人自體脂肪間充質干細胞治療骨關節炎的臨床研究

韓健，殷振華，李富航，張亞軍，陳軻，王煒，董輝輝，劉一海，李永恒，汪玉良

(1.蘭州大學第二臨床醫學院骨科，甘肅 蘭州 730030；2.陜西省咸陽市第一人民醫院骨一科，陜西 咸陽 712000)

人自體脂肪間充質干細胞治療骨關節炎的臨床研究

韓健1，2，殷振華2，李富航2，張亞軍2，陳軻2，王煒2，董輝輝2，劉一海2，李永恒2，汪玉良1*

(1.蘭州大學第二臨床醫學院骨科，甘肅 蘭州 730030；2.陜西省咸陽市第一人民醫院骨一科，陜西 咸陽 712000)

目的 探討人自體脂肪間充質干細胞(adipose derived stem cells，ADSCs)復合玻璃酸鈉、富血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)注射治療膝關節骨關節炎的安全性和有效性。方法 取人腹部脂肪組織，分離獲取ADSCs，經體外培養獲得足量的ADSCS，并以流式細胞儀檢測其表面標志物，分析成軟骨細胞分化能力。選擇咸陽市第一人民醫院骨科中心門診30例膝關節輕中度骨關節炎患者，關節腔內注射人ADSCs復合玻璃酸鈉、富血小板血漿，評價觀察干預前、后的患者是否有不良反應以及膝關節活動度的評分、疼痛視覺模擬評分(visual analogue scale，VAS)、核磁共振下膝關節面。結果 人腹部脂肪組織分離出來的ADSCs均陽性表達CD105、CD29，陰性表達CD45、CD34，體外具有良好的成骨、成脂、成軟骨能力；臨床治療干預后患者無不良反應，膝疼痛減輕，關節活動度較前增大，核磁共振可見關節面斑片狀影較治療前顯著減少，低信號區顯著減少，未見明顯關節腔積液，關節面厚度增加。結論 關節腔注射ADSCs復合玻璃酸鈉、富血小板血漿治療骨關節炎能有效改善患者膝關節活動度，減少疼痛，提高生活質量，通過核磁共振發現關節面厚度增加，延緩關節退化。

脂肪間充質干細胞；軟骨細胞；OA

骨關節炎(osteoarthritis，OA))是一種退行性關節疾病，又稱退行性關節炎或骨關節疾病，是一種中老年人群中的常見病。患者機體軟骨組織蛻變中過程，常伴隨有免疫反應產生的各種炎癥因子。該疾病在軟骨組織發生改變后，會導致患者關節疼痛，關節僵硬及功能喪失，嚴重影響人們的生活質量，并增加了生活負擔。研究表明，導致OA發生的因素有很多，包括年齡、職業、生活習慣、四頭肌薄弱、關節受力異常及穩定性減弱、肥胖、遺傳、外傷、內分泌紊亂、生長因子及免疫因子缺乏等。疾病初期以保守治療為主，發展后期為關節置換[1]。

隨著再生醫學技術的發展，細胞工程技術和組織工程技術已經在軟骨缺損治療領域得到10多年安全性和有效性檢驗，有些已經通過FDA認證，并且已經初步開始商業化，比如美國健贊公司的基質誘導自體軟骨細胞移植等[2]。脂肪間充質干細胞(adipose derived stem cells，ADSCs)取材來源方便，且具有多能性，已經得到很多專家的關注[3]。但因體外培養ADSCs涉及到倫理學，因此本試驗采用直接提取分離的方法來驗證ADSCs治療OA臨床安全性和有效性。在實驗室通過對人腹部脂肪進行體外分離培養，誘導成脂、成骨、成軟骨以及細胞表面標記鑒定ADSCs，觀察其成軟骨活性。臨床抽取患者腹部脂肪組織，體外分離純化，復合玻璃酸鈉、自體富含血小板血漿(platelet rich plasma，PRP)，注射到患者患有OA的關節腔，初步探討患者自體ADSCs治療OA的安全性和有效性。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 本試驗所用脂肪組織取自于人體腹部脂肪(患者來自咸陽市第一人民醫院)，均取得知情同意。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(杭州四季青)，四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)(南京建成)，達爾伯克必需基本培養基(dulbecco minimumessential medium，DMEM)粉劑(GIBCO，美國)；I型膠原酶(Sigma，美國)；玻璃酸鈉(景峰制藥)。

1.1.2 臨床患者信息 患者為咸陽市第一人民醫院骨科中心自2014年8月至2015年8月的門診患者，膝關節骨關節炎30例，否認高血壓、糖尿病、腦梗塞等慢性病，試驗前同意參加臨床試驗并簽署書面知情同意書，充分了解試驗倫理批件。治療期間資料均完整。采用自體對照。女性21例，男性9例；年齡為40～65歲，平均約48.4歲；病程2～12年，平均5.6年。此臨床試驗患者治療前患者膝關節無有創檢查及手術史。

1.1.3 臨床患者骨關節炎診斷參考標準 a)發病年齡大于或等于40歲；b)膝關節輕度靜息痛，活動后加重；c)晨僵小于30 min；d)關節彈響及關節壓痛；e)關節活動度下降；f)X線片示膝關節非對稱性間隙變窄，軟骨下骨硬化；g)關節腫大。

1.2方法

1.2.1 人腹部ADSCs的分離培養 無菌條件下取人腹部脂肪組織，0.1%I型膠原酶、37℃消化45 min，終止消化，篩網過濾后1 200 rpm離心10 min收集沉淀。DMEM培養液(含10%胎牛血清)重懸細胞，以2×104/cm2密度接種至培養皿中；在條件為37℃、5%CO2的培養箱中培養，48h后首次換液，棄去未貼壁細胞。待細胞生長至80%～90%融合時傳代，隔天更換培養液。

1.2.2 ADSCs定向誘導分化

1.2.2.1 成脂肪細胞誘導 a)取第3代的人脂肪間充質干細胞，以4.0×104/mL密度接種于預先放置了細胞爬片的孔板中，繼續培養。待細胞爬滿玻片后換成脂誘導培養基(高糖DMEM、10%胎牛血清、1 mmol/L地塞米松、10 mg/L胰島素、50 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-Isobutyl-1-methylanxthine，IBMX)、吲哚美辛0.2 mmol/L)。誘導分化2周，每3天換液1次，倒置相差顯微鏡觀察。b)組織學染色檢測：取成脂誘導2周后的爬片，10%甲醛溶液固定10 min后水洗，油紅O染液染色[4]10～15 min，純化水清洗后顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2.2 成骨細胞誘導 a)取第3代的人脂肪間充質干細胞，以4.0×104/mL密度接種于預先放置了細胞爬片的孔板中，持續培養。待細胞爬滿玻片后用換成骨誘導培養基(達氏修正依氏培養基、10% FBS、地塞米松1 mmol/L、Vc 50 μg/ mL、β-磷酸甘油10 mmol/L)。誘導分化2周，每3天換液1次，倒置相差顯微鏡觀察。b)組織學染色檢測：取成骨誘導2周后的爬片，10%甲醛溶液固定10 min后水洗，茜素紅染液染色[5]10～15 min，純化水清洗后顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2.3 成軟骨細胞誘導 a)取第3代的人脂肪間充質干細胞，以4.0×104/mL密度接種于預先放置了細胞爬片的孔板中。將分離培養的軟骨細胞(第2代)培養上清(2 200 rpm離心)與新鮮DMEM(+10%FBS)1︰1混合成誘導培養液誘導加入誘導分化2周，倒置相差顯微鏡觀察。b)組織學染色檢測：10%甲醛溶液固定10 min后水洗，甲苯胺藍染色10～15 min，純化水清洗后顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 患者脂肪組織獲取及脂肪間充質干細胞的分離 選擇患者腹部脂肪較膨隆處作為供區，采用標準腫脹麻醉法(2%利多卡因15 mL、1︰1 000鹽酸腎上腺素1 mL、生理鹽水210 mL)。選取長度合適的吸脂針，應用Lipokit技術的振蕩注射器負壓吸引抽吸脂肪約100 mL。抽脂后采用腹部多頭腹帶加壓包扎。超凈臺內用PBS緩沖液清洗組織并去除肉眼可見血管組織，眼科剪剪碎后用0.1%Ⅰ型膠原酶37℃振蕩消化60 min。終止消化后用200目篩網過濾，去除未消化組織，1 200 rpm離心10 min后收集沉淀，重懸后臺酚藍染色法計數并行活性細胞計數，每例患者留取2×107個細胞備用。

1.2.4 自體PRP制備 采集患者自體靜脈血約50 mL，血袋中臨時保存標本，采用兩次離心法制備PRP，保存備用。

1.2.5 患者ADSCs復合透明質酸鈉及PRP注射 將患者自體脂肪間充質干細胞用10% PRP(約7.5 mL)重懸(CaCl2激活)，與2.5 mL玻璃酸鈉混勻，備用。患者平臥位，膝關節屈曲約45°，保持穩定。皮膚表面消毒后，采用膝關節腔外側穿刺入路，10 mL注射針頭穿刺進入關節腔內，回抽有少量關節液，無回血后注入治療劑量10 mL，無菌包扎。治療前1個月及治療后觀察期間均不使用其他任何治療藥物。

1.2.6 觀察指標 分別于治療前及治療后第1、2、3個月評價以下指標。a)使用視覺模擬評分(visual analogue scale，VAS)，記分1～10分；運動性疼痛評估平路行走、上下樓梯以及完全蹲立的疼痛，以此來評價VAS評分。b)關節活動功能。記錄膝關節活動時是否伴隨彈響、關節僵硬以及關節絞鎖，陽性一項記1分。c)膝關節MRI檢查。于術前、術后1個月、術后2個月以及術后3個月采用核磁共振儀器行膝關節MRI掃描，使用膝關節線圈，取矢狀面，采用脂肪抑制三維穩態自由進動序列觀察，512×512矩陣，180 mm視野，1.5 mm層厚，28°翻轉角，38 ms重復激發時間，10 ms回波時間，1次激勵次數，觀察膝關節軟骨信號的改變及范圍變化，反復多次測量脛骨內側平臺軟骨面厚度，取其均值。

1.2.7 療效評價 臨床癥狀改善率=(治療前分值-治療后分值)/治療前分值×100%。差：疼痛評分減小小于30%或疼痛無改善、關節活動度無改觀。一般：疼痛評分減小約30%～50%，關節活動度初步改觀。良：疼痛評分減小約50%～80%，關節活動度得到顯著改觀。優：疼痛評分減小約大于等于80%或完全改觀，關節活動度無影響。

2 結 果

2.1 ADSCs形態學觀察 細胞接種后24 h開始貼壁，初為小圓形，細胞大小不等。48 h后大部分細胞已貼壁生長，多呈長梭形(見圖1)。

2.2 ADSCs定向誘導分化

2.2.1 成脂誘導形態觀察及鑒定 細胞于誘導開始后即停止分裂增殖，逐漸由長梭形變為不規則圓形，體積變大，但大小不一。最早于誘導后4 d時可在細胞內看到小脂滴，厚脂滴逐漸增多，可互相融合成較大的脂滴。誘導14 d時細胞分化至高峰，油紅O染色即可證實為脂滴(見圖2)。

2.2.2 成骨誘導形態觀察及鑒定 人脂肪間充質干細胞經成骨誘導培養液培養21 d，細胞形態由梭形改為多角形，細胞呈多層性、重疊排列，其間質內含大量礦鹽沉積的鈣化結節，茜素紅染色可呈現紅色(見圖3)。

2.2.3 成軟骨細胞形態觀察及鑒定 單個細胞形態未見明顯改變，隨著誘導時間延長，在細胞密度較大處細胞群逐漸簇集。誘導7 d后即可在簇集細胞的表面見到淡黃色的物質沉積，后逐漸增多，到14 d時可達高峰。甲苯胺藍染色后細胞核呈藍紫色，基質呈藍色(見圖4)。

2.3 ADSCs表面標記物的表達 取擴增培養后第3代ADSCs，胰蛋白酶消化后，PBS清洗2遍，并制備成1.5×106/mL的細胞懸液。經流式細胞儀檢測，ADSCs均一地表達CD29、CD105，陽性率分別為91.8%，和97.5%；而CD34、CD45，陽性率分別為1.4%，1.8%(見圖5)。

2.4 安全性和有效性評價

2.4.1 VAS疼痛評分及關節功能評價 治療后疼痛評分較治療前明顯減小，治療后1個月VAS疼痛評分及關節活動評分較治療前均未見明顯性差異(P>0.05)；疼痛評分在治療后第2個月、第3個月相較于治療前均差異有統計學意義(P<0.05)，關節活動功能評分于治療后第2月、第3個月均較治療前有顯著性差異(P<0.05，見表1)。本實驗30例患者治療效果：差2例(6.67%)，一般4例(13.33%)，良6例(20.00%)，優18例(60.00%)。全體患者取脂肪處及關節穿刺部位均未見明顯出血、細菌感染、局部皮膚過敏等不良反應，2例抽脂后感腹部不適，3d后癥狀消失，3例自覺穿刺部位稍疼痛，2d后緩解。

表1 治療前后VAS疼痛評分以及關節活動功能比較±s)

2.4.2 MRI下膝關節軟骨面信號及厚度變化 治療前，于核磁共振序列中關節面體現為中信號強度的斑片狀影，環繞脛骨平臺及股骨內外髁骨皮質。治療后1個月可見關節面斑片狀影無顯著變化，局部可見凹陷形成、信號減低，關節腔可見少量積液；治療后2個月可見關節面斑片狀影相較于治療前及1個月時減少，低表達信號區較前有所減少，關節腔積液較前有所減少。治療后3個月關節面斑片狀影較治療前顯著減少，大致接近正常，低信號區顯著減少，未見明顯關節腔積液(見圖6)，可見脛骨平臺輕度水腫，脛骨平臺及股骨髁輪廓示厚度大致正常。本試驗即觀察核磁共振下軟骨面的T2值來檢測軟骨面厚度。治療前T2值(84.65±1.68)，治療后1個月T2值(79.83±0.85)，治療后2個月T2值(76.79±1.32)，治療后3個月T2值(66.37±1.18)。治療后3個月T2測量值較治療前明顯減少(P<0.05)，差異具有統計學意義。

圖1 原代人脂肪間充質干細胞形態學觀察×40 圖2 誘導成脂細胞油紅染色×100

圖3 誘導成骨細胞茜素紅染色×40 圖4 甲苯胺藍染色結果×40

a CD29 b CD105 c CD34 d CD45

圖5 流式細胞儀檢測第3代ADSCs免疫表型

a 治療前 b 治療后1個月 c 治療后2個月 d 治療后3個月

圖6 MRI掃描觀察軟骨厚度及信號(T2)改變

3 討 論

研究表明個體因素以及關節活動是引起骨關節炎的主要因素。其可導致關節面軟骨細胞、細胞外基質以及軟骨下骨的降解與失平衡。目前臨床上，針對骨關節炎現有的治療方法包括非藥物治療、藥物治療及手術治療。其中輕中度、年輕患者，主要給予理療、口服非甾體類消炎止痛藥等治療，只能達到短暫的緩解疼痛的目的，無法延緩病情的進展乃至“根治”，且此類藥物的不良反應屢見報道。最近再生醫學的發展為治療OA帶來一線希望。

1994年Brittberg等[6]研究表明，使用自體軟骨細胞移植技術治療23例膝關節軟骨缺損患者。術后隨訪16～66個月(平均39個月)，所有患者的臨床癥狀包括關節疼痛、腫脹、骨擦音均得到改善，并且組織學研究表明生成的是透明軟骨組織。研究表明ADSCs具有多能性能，具有成脂肪、成骨以及成軟骨的能力。2012年有學者研究表明關節腔注射骨髓間充質干細胞能夠使OA動物模型得關節軟骨再生[7]。2012年有研究表明骨髓間充質干細胞(bone marrow stem cells，BMSCs)能延遲羊骨關節炎進展以及改善關節軟骨組織[8]。以上研究表明關節內微環境能夠促使BMSCs向軟骨方向分化，延遲關節退化。但是BMSCs取材不方便，以及鑒于目前體外培養的倫理學要求，我們選用取材方便，且具有多能性的ADSCs作為種子細胞來研究它對OA的治療作用。我們在軟骨缺損動物實驗中已經發現自體脂肪間充質干細胞可以生成透明軟骨組織。脂肪間充質干細胞源于自體脂肪組織，相較于骨髓間充質干細胞，其具有無免疫排斥性、創傷小、取材便利并可反復取材、來源廣泛等特點，且其同樣具有多向誘導分化潛能，成脂肪細胞、成骨細胞、成軟骨細胞等[9-11]。另外PRP來源于自體，具有多種生長因子，不存在免疫排斥反應，取材方便、制作簡單。為了模擬體內環境，我們旨在使用人自體脂肪干細胞ADSCs提供種子細胞，利用PRP中多種生長因子和關節腔內微環境促進人自體脂肪干細胞生長分化成軟骨細胞進而生成透明軟骨組織，聯合治療骨關節炎，改善患者生活質量，期待能有部分逆轉退化速度的作用。

本研究結果證眀患者無不良反應，通過患者疼痛VAS評分以及關節活動評分可知，2個月以及3個月后相較于治療前，兩個評分結果都有所改善，說明人自體腹部ADSCs復合玻璃酸鈉、PRP注射治療膝關節骨關節炎有明顯的改善癥狀作用。當然遠期效果需要更多樣本、更長時間的隨訪。本研究還采用核磁共振來檢測軟骨面厚度。治療后2個月及3個月相較于治療前關節軟骨厚度均有所改善，而T2測量值于治療后3個月較治療前明顯減少。說明該方法對膝關節骨關節炎軟骨退變具有一定治療效果。故此推斷本實驗療效原理：治療前期玻璃酸鈉潤滑應用關節面，然后脂肪干細胞貼附關節面，在PRP營養和微環境共同作用誘導分化為軟骨細胞，后軟骨細胞增生、傳代，從而達到關節軟骨治療與修復的可能。

綜上所述，人自體ADSCs復合玻璃酸鈉和富血小板血漿注射治療膝關節骨關節炎能有效改善關節活動度，減輕疼痛，提高患者生活質量，延緩關節退化。但其遠期效果及具體機制需要更深入一步的組織學研究。

致謝：感謝西安市中心醫院燒傷整形科陶諫主任醫師、田智泉碩士、張明濤碩士的技術指導。

[1]錢春美，沈艷婷，袁秀榮，等.骨關節炎研究進展[J].吉林中醫藥，2016，36(5)：538-540.

[2]張柏青，張仲文，葉啟彬.基質誘導自體軟骨細胞移植與軟骨缺損的修復[J].中國矯形外科雜志，2008，16(23)：1796-1798.

[3]美麗，劉少英，劉福艷，等.脂肪組織來源干細胞治療骨關節炎研究進展[J].國際骨科學雜志，2016，37(2)：102-105.

[4]Fischbach C，Seufert JH，Hacker M，et al.Three-dimensional in vitro model of adipogenesis：comparison of culture conditions.[J].Tissue Engineering，2004，10(1-2)：215-229.

[5]Fischbach C，Spruss TB，Neubauer M，et al.Generation of mature fat pads in vitro and in vivo utilizing 3-D long-term culture of 3 T3～L1preadipocytes[J].Experimental Cell Research，2004，300(1)：54-64.

[6]Brittberg M，Lindahl A，Nilsson A，et al.Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation[J].N Engl J Med，1994，331(14)：889-895.

[7]Mitsuhiko Sato，Kenzo Uchida，Hideaki Nakajima，et al.Direct transplantation of mesenchymal stem cells into the knee joints of Hartley strain guinea pigs with spontaneous osteoarthritis.[J].Arthritis Research & Therapy，2012，14(1)：R31[8]Al Faqeh H，Bin Nor Hamdan BM，Chen HC.The potential of intra-articular injection of chondrogenic-induced bone marrow stem cells to retard the progression of osteoarthritis in a sheep model[J].Experimental Gerontology，2012，47(6)：458-464.

[9]Huang JI，Zuk PA，Jones NF，et al.Chondrogenic potential of multipotential cells from human adipose tissue.[J].Plastic & Reconstructive Surgery，2004，113(2)：585-594.

[10]Cowan CM，Shi YY，Aalami OO，et al.Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects[J].Nature Biotechnology，2004，22(5)：560-567.

[11]Zuk P A，Zhu M，Ashjian P，et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J].Molecular Biology of the Cell，2003，13(12)：4279-4295.

Clinical Study of Autologous Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells in the Treatment of Osteoarthritis

Han jian1，2，Yin Zhenhua2，Li Fuhang2，et al

(1.Department of Orthopedics，the Second Clinical Medical College of Lanzhou University，Lanzhou 730030，China；2.The Orthopedics of The First People’s Hospital of Xianyang City，Xianyang 712000，China)

Objective To discusses the safety and effectiveness of the treatment injection for knee osteoarthritis by using a utologous ADSCS composite sodium hyaluronate，platelet rich plasma (PRP).Methods Take the abdominal adipose tissue，get hADSCs separation，plenty of ADSCS obtained with in vitro culture，and by flow cytometry instrument to detect the surface markers and analysis into cartilage cells differentiation ability.30 patients with mild-to-moderate of knee joint osteoarthritis were selected from the orthopedic outpatient service center in the first people’s hospital of Xianyang city.ADSCs composite sodium hyaluronate，platelet rich plasma were injected into patient’s articular cavity.The indicators such as patients with adverse reactions，knee activity score，pain visual analogue scale (VAS) score as well as the surface of knee join under MRI were evaluated before and after the intervention.Results Abdominal adipose tissue separated hADSCs were positive expression of CD105 and CD29，CD45，CD34 negative expression，in vitro with good osteogenesis，into fat，cartilage capacity；There was no adverse reaction in the patients who suffered clinical intervention.And patient’s knee pain relief，activity range was improved compared with before treatment.MRI imaging showed that the patchy shadow in the area of the joint surface and low signal area were significantly reduced.There was no obvious joint effusion，and the thickness of articular surface was increased.Conclusion The articular cavity injection therapy with ADSCs compound sodium hyaluronate，platelet rich plasma (PRP) for patients who suffered with osteoarthritis can effectively improved the knee joint motion，to reduce pain and improve the quality of life.The thickness of the joint surface was increased and the joint degeneration was delayed by MRI imaging.

adipose derived stem cells；chondrocytes；osteoarthritis

閆斌(1978- )，男，主治醫師，新疆醫科大學第二附屬醫院外二科，830063。

1008-5572(2017)03-0235-05

咸陽市2014年科學技術研究計劃項目(2014K04-13)；*本文通訊作者：汪玉良

R684.3

A

2016-12-15

韓健，殷振華，李富航，等.人自體脂肪間充質干細胞治療骨關節炎的臨床研究[J].實用骨科雜志，2017，23(3)：235-239.