HBV DNA整合與肝癌關(guān)系的研究進展

方向，鄧偉

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所，南寧530021)

·綜述·

HBV DNA整合與肝癌關(guān)系的研究進展

方向，鄧偉

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所，南寧530021)

乙型肝炎病毒(HBV)與人基因組整合在肝細胞癌發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前研究表明，HBV包含編碼表面(S)、核心(C)、聚合酶(P)和X蛋白的4個開放閱讀框(ORF)，均可以形成斷裂位點整合到人基因組，其整合率從高至低依次是X區(qū)、S區(qū)、C區(qū)和P區(qū)。HBV在人染色體上的整合位點并非隨機分布，而是存在與肝癌相關(guān)的潛在優(yōu)勢整合位點，這些優(yōu)勢整合位點附近的基因常常涉及到細胞生長、增殖、分化和永生化。HBV DNA整合入人基因組后，通過影響整合位點周圍基因功能、形成具有致癌作用的HBV截短蛋白以及增加人染色體的不穩(wěn)定性促使肝細胞的癌變。

乙型肝炎病毒；DNA整合；肝細胞癌；宿主基因組；遺傳信息；染色體異位；堿基缺失

肝細胞癌(簡稱肝癌)是常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率居惡性腫瘤的第3位。全球每年有大約60萬人死于肝癌，其中將近一半發(fā)生在中國[1]。乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是我國肝癌最重要的危險因素，在HBV慢性感染期間，HBV可以通過DNA整合來影響整合位點周圍基因功能，破壞或促進對細胞生長和分化至關(guān)重要基因的表達，從而促進肝細胞惡性轉(zhuǎn)化[2]。目前研究[3～6]證實，HBV DNA可通過整合進入宿主基因組促使肝細胞癌變。現(xiàn)將HBV整合與肝癌關(guān)系的研究進展綜述如下。

1 HBV整合的機制與特點

1.1 HBV整合機制 1980年人們首次在HBV相關(guān)性肝癌患者體內(nèi)中檢測到HBV DNA與人染色體整合[7]。HBV復(fù)制過程中存在反轉(zhuǎn)錄這一特殊階段，人體感染HBV后，HBV病毒成熟體通過黏附進入到肝細胞，HBV DNA疏松的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(rcDNA)首先轉(zhuǎn)變?yōu)殚]合環(huán)狀DNA(cccDNA)，接著cccDNA轉(zhuǎn)錄為前基因組RNA(pgRNA)進入細胞質(zhì)，然后反轉(zhuǎn)錄為rcDNA，rcDNA再次進入肝細胞核循環(huán)。在cccDNA的循環(huán)中，部分rcDNA可能復(fù)制失敗，形成雙鏈線型DNA(d1DNA)，d1DNA可以在斷裂DNA修復(fù)過程中再次整合入宿主基因。同時，HBV感染可造成其雙鏈DNA斷裂(DsBs)，DsBs修復(fù)途徑可以把不同來源的非鄰近的DNA片段拼接起來，這就為HBV整合入宿主基因提供了分子基礎(chǔ)。HBV整合至宿主基因組中有利于其持續(xù)感染，長期慢性炎癥可以導(dǎo)致肝細胞生命周期改變和增殖，增加宿主基因組DNA終端數(shù)量，反過來又有利于HBV DNA整合到宿主基因組中[8]。

1.2 HBV整合特點 HBV是具有松弛環(huán)形部分雙鏈的DNA病毒，全長3 200 bp，由長短2條鏈組成。其中長鏈為負鏈，攜帶編碼HBV蛋白的所有遺傳信息，其包含編碼表面(S)、核心(C)、聚合酶(P)和X蛋白的4個重疊的開放閱讀框(ORF)。理論上4個ORF均可以形成斷裂位點插入到人基因組，但研究發(fā)現(xiàn)它們整合的頻率并不相同，其整合率從高至低依次是X、S、C、P，目前尚無完整HBV DNA整合到人基因組的病例報道。HBV這4個ORF在與人染色體整合后會重新排列，這種排列紊亂會導(dǎo)致基因表達異常，如果這種異常不斷疊加，最終會促使細胞癌變。

X基因是HBV DNA中最小的一個ORF，Jiang等[9]對癌組織與癌旁組織進行對照，發(fā)現(xiàn)癌組織和癌旁組織中均存在整合，HBV整合部位平均分布在DR1和DR2附近。但屠紅等[10]對40例肝癌病例整合位點的研究發(fā)現(xiàn)，HBV DNA整合可發(fā)生在X基因的任意長度，并非只出現(xiàn)在HBV DR1和DR2區(qū)，X基因有96%以截短形式插入宿主細胞DNA。研究表明，C-末端截短的HBX可以通過Stat3/Nanog級聯(lián)反應(yīng)增強肝癌干細胞樣特性，在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[11]。另外，C-末端截短的HBX可以促進CD133肝癌干細胞亞型的出現(xiàn)，并在肝癌中表現(xiàn)出惡性和干細胞樣特征，通過激活法尼酯衍生物X受體(FXR)介導(dǎo)癌癥干細胞作用[12]。HBX蛋白作為反式激活因子，可以影響調(diào)節(jié)性非編碼RNA(ncRNA)，包括microRNA和長ncRNA，HBX也參與表觀遺傳修飾和DNA修復(fù)，HBX與各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相互作用，如p53、Wnt和核因子-κB通路[13]。另外，X蛋白還可引起肝癌中p21、p16、p62myc、c-myc、p2lras等癌基因和抑癌基因高表達[14，15]。另一個經(jīng)常出現(xiàn)斷裂整合的HBV基因是pre-S2/S基因，其編碼3種不同結(jié)構(gòu)相關(guān)的包膜蛋白，pre-S2蛋白可以作為反式激活因子，并與人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(hTERT)啟動子相互作用，增加端粒酶活性[16]。pre-S2/S基因還可以產(chǎn)生截短的pre-S2/S蛋白，在大量肝癌組織中可以檢測到截短的pre-S2/S蛋白，這種截短的蛋白有與c-myc和c-fos相類似的反式激活作用，可以通過激活與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的級聯(lián)反應(yīng)，提高肝細胞的增生率[17]。

HBV整合可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型，Ⅰ型整合起始于DRl向負鏈3端延伸；Ⅱ型整合也起始于DRl，但延伸方向和Ⅰ型相反；Ⅲ型整合起自DR2向負鏈3端延伸；Ⅳ型整合也起自DR2，延伸方向和Ⅲ型相反。Chauhan等[18]報道，土撥鼠在感染HBV和土撥鼠肝炎病毒1 h后，其肝組織內(nèi)可以檢測到HBV和土撥鼠肝炎病毒DNA及其復(fù)制中間體，同時可以檢測到HBV DNA整合到宿主基因中，在感染后1 h和3 h可以檢測到土撥鼠肝炎病毒X和pre-S序列插入宿主基因組。該研究證實自然條件下的肝炎病毒在入侵后不久就可以整合入肝細胞DNA。

2 HBV在人染色體上的整合位點

目前在人23對染色體中均發(fā)現(xiàn)HBV DNA的整合，因此有學(xué)者認為，HBV DNA在人染色體中的整合是隨機的[19]。但是，隨著對HBV DNA整合研究的深入以及第二代測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的整合位點被發(fā)現(xiàn)。有研究表明，在癌組織中，HBV在染色體5、8、10、19中整合常見，在癌旁組織中，HBV在1號和2號染色體上整合更常見；每個染色體上的整合位點數(shù)量與非腫瘤組織中脆性位點的數(shù)量相關(guān)，而與肝癌組織無關(guān)[20]。Zhao等[22]發(fā)現(xiàn)，HBV傾向于整合在染色體脆性位點和包括CpG島的功能基因區(qū)，并且優(yōu)先整合17號染色體[21]。近年研究顯示，HBV整合存在相對熱點區(qū)段，HBV整合傾向于發(fā)生在染色體轉(zhuǎn)錄區(qū)域和重復(fù)序列，包括長散布核元素(LINE)、短散點核因子(SINE)和Alu序列。盡管目前所發(fā)現(xiàn)的熱點整合位點只能代表總體事件中的一小部分，但是反復(fù)發(fā)生的整合插入位點表明HBV存在與肝癌相關(guān)的潛在優(yōu)勢整合位點。最常見的HBV整合事件位于TERT和骨髓/淋巴或混合白血病4(MLL4)，TERT在覆蓋細胞衰老中起重要作用，細胞衰老通常在大多數(shù)癌細胞中上調(diào)，MLL4編碼組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，其在癌基因組的表觀遺傳修飾中具有關(guān)鍵作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的HBV DNA在人基因組上整合的腫瘤相關(guān)靶基因有100多個，包括MLL4、TERT、纖連蛋白1、SMAD家族成員5SMAD5、細胞周期蛋白A、細胞周期蛋白E1、Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子GEF12、磷酸酶和肌動蛋白調(diào)節(jié)物4、鈣信號相關(guān)基因、RNA結(jié)合蛋白fox-1同系物、醇脫氫酶1B、氨基甲酰磷酸合成酶1、雌激素相關(guān)受體γ、視黃酸誘導(dǎo)的1、CTD小磷酸酶、低密度脂蛋白相關(guān)性蛋白1B、sentrin特異性肽酶5、PDGF受體等，這些基因涉及到細胞生長、增殖、分化和永生化。

3 HBV DNA整合致肝癌的主要機制

Jiang等[23]報道，在60例HBV相關(guān)性肝癌患者癌組織及癌旁組織中都存在相同的X基因C-末端截短基因，此外，兩組的病毒序列具有相似的C1653T、A1762T/G1764A低頻率突變，HBV插入的頻率和模式在癌組織和癌旁組織之間相似，表明大部分HBV DNA整合事件與肝癌的發(fā)生無關(guān)。關(guān)于HBV整合的致癌機制，有研究認為HBV整合的相關(guān)基因突變和HBV整合引起的染色體穩(wěn)定性改變與肝細胞癌變有關(guān)。但是，目前普遍認為HBV整合導(dǎo)致肝癌的機制包括以下3個方面。

3.1 影響整合位點周圍基因的功能 Cao等[24]使用名為“病毒掃描”的生物學(xué)信息系統(tǒng)，在3例肝癌患者癌組織中發(fā)現(xiàn)HBV整合到KMT2B基因，但對應(yīng)的癌旁組織未發(fā)現(xiàn)，由此推測HBV整合誘導(dǎo)宿主驅(qū)動基因的改變可能會促使病毒癌基因表達和肝癌進展。HBV基因組攜帶著諸多轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)元件，如增強子1、增強子2、負性調(diào)控元件、核心上游調(diào)節(jié)序列、基本核心啟動子等，HBV DNA通過整合嵌入人基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，通過這些調(diào)控元件影響HBV整合位點周圍基因功能，從而導(dǎo)致肝癌發(fā)生。

3.2 形成具有致癌作用的HBV截短蛋白 在HBV相關(guān)性肝癌中存在有大量截短的X蛋白，Tu等研究顯示，全長的X蛋白可以抑制ras與myc引起的集落生長的功能，截短的X蛋白可以加強ras與myc的轉(zhuǎn)化功能。整合的HBV DNA能夠表達合成成熟的pre-S/S和X蛋白觸發(fā)級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時也可以促使肝細胞惡變。

3.3 增加人基因的不穩(wěn)定性 HBV DNA整合到人基因組可引起人染色體DNA的缺失和易位以及細胞DNA的擴增和融合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而增加基因組DNA的脆性和不穩(wěn)定性。在肝癌組織中可以檢測到17p13、4q32、llpl4、4q32、11q13等區(qū)域的小片段缺失，有研究[25]在肝癌組織中發(fā)現(xiàn)HBV DNA整合位點兩端出現(xiàn)17號與18號染色體易位，并且18號染色體整合位點附近出現(xiàn)堿基缺失。

4 展望

目前已經(jīng)初步探明了HBV的整合機制，并檢測到了一些常見整合位點和受累基因，其中Pang等[26]通過量化HBV DNA與肝癌患者白細胞基因組的整合，確定OR4F3和OR4F17的組合是HBV相關(guān)疾病的新型潛在生物標(biāo)志物。但是，對于HBV DNA整合導(dǎo)致肝細胞癌變的確切機制目前尚不完全清楚。HBV DNA整合與肝癌的關(guān)系非常復(fù)雜，不僅需要精心設(shè)計的流行病學(xué)研究，還需要對常見整合基因進行體外細胞功能試驗和動物模型試驗，為肝癌的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

[1] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2016[J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(1):7-30.

[2] Wang M, Xi D, Ning Q. Virus-induced hepatocellular carcinoma with special emphasis on HBV[J]. Hepatol Int, 2017,11(2):171-180.

[3] Lee S, Lee MJ, Zhang J, et al. C-terminal-truncated HBV X promotes hepato-oncogenesis through inhibition of tumor-suppressive beta-catenin/BAMBI signaling[J]. Exp Mol Med, 2016,48(12):e275.

[4] Levrero M, Zucman-Rossi J. Mechanisms of HBV-induced hepatocellular carcinoma[J]. J Hepatol, 2016,64(1 Suppl):S84-101.

[5] Takeda H, Takai A, Inuzuka T, et al. Genetic basis of hepatitis virus-associated hepatocellular carcinoma: linkage between infection, inflammation, and tumorigenesis[J]. J Gastroenterol, 2017,52(1):26-38.

[6] Kawai-Kitahata F, Asahina Y, Tanaka S, et al. Comprehensive analyses of mutations and hepatitis B virus integration in hepatocellular carcinoma with clinicopathological features[J]. J Gastroenterol, 2016,51(5):473-486.

[7]Bonilla Guerrero R, Roberts LR. The role of hepatitis B virus integrations in the pathogenesis of human hepatocellular carcinoma[J]. J Hepatol, 2005,42(5):760-777.

[8] Ringelhan M, Heikenwalder M, Protzer U. Direct effects of hepatitis B virus-encoded proteins and chronic infection in liver cancer development[J]. Dig Dis, 2013,31(1):138-151.

[9] Jiang Z, Jhunjhunwala S, Liu J, et al. The effects of hepatitis B virus integration into the genomes of hepatocellular carcinoma patients[J]. Genome Res, 2012,22(4):593-601.

[10] 屠紅,高海峰,馬國豪,等.肝癌中乙型肝炎病毒整合位點的研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2006,86(18):1249-1252.

[11] Ching RHH, Sze KMF, Lau EYT, et al. C-terminal truncated hepatitis B virus X protein regulates tumorigenicity, self-renewal and drug resistance via STAT3/Nanog signaling pathway[J]. Oncotarget, 2017,8(14):23507-23516.

[12] Ng KY, Chai S, Tong M, et al. C-terminal truncated hepatitis B virus X protein promotes hepatocellular carcinogenesis through induction of cancer and stem cell-like properties[J]. Oncotarget, 2016,7(17):24005-24017.

[13] Geng M, Xin X, Bi LQ, et al. Molecular mechanism of hepatitis B virus X protein function in hepatocarcinogenesis[J]. World J Gastroenterol, 2015,21(38):10732-10738.

[14]Qadri I, Fatima K, Abde LHH. Hepatitis B virus X protein impedes the DNA repair via its association with transcription factor, TFIIH[J]. BMC Microbiol, 2011,11:48.

[15] Knoll S, Furst K, Thomas S, et al. Dissection of cell context-dependent interactions between HBx and p53 family members in regulation of apoptosis: a role for HBV-induced HCC[J]. Cell Cycle, 2011,10(20):3554-3565.

[16] Wang LH, Huang W, Lai MD, et al. Aberrant cyclin A expression and centrosome overduplication induced by hepatitis B virus pre-S2 mutants and its implication in hepatocarcinogenesis[J]. Carcinogenesis, 2012,33(2):466-472.

[17] Park NH, Song IH, Chung YH. Chronic hepatitis B in hepatocarcinogenesis[J]. Postgrad Med J, 2006,82(970):507-515.

[18] Chauhan R, Churchill ND, Mulrooney-Cousins PM, et al. Initial sites of hepadnavirus integration into host genome in human hepatocytes and in the woodchuck model of hepatitis B-associated hepatocellular carcinoma[J]. Oncogenesis, 2017,6(4):e317.

[19] Sung WK, Zheng H, Li S, et al. Genome-wide survey of recurrent HBV integration in hepatocellular carcinoma[J]. Nat Genet, 2012,44(7):765-769.

[20] Yang X, Wu L, Lin J, et al. Distinct hepatitis B virus integration patterns in hepatocellular carcinoma and adjacent normal liver tissue[J]. Int J Cancer, 2017,140(6):1324-1330.

[21] Zhao LH, Liu X, Yan HX, et al. Genomic and oncogenic preference of HBV integration in hepatocellular carcinoma[J]. Nat Commun, 2016,7:12992.

[22] Lau CC, Sun T, Ching AK, et al. Viral-human chimeric transcript predisposes risk to liver cancer development and progression[J]. Cancer cell, 2014,25(3):335-349.

[23] Jiang S, Yang Z, Li W, et al. Re-evaluation of the carcinogenic significance of hepatitis B virus integration in hepatocarcinogenesis[J]. PLoS One, 2012,7(9):e40363.

[24] Cao S, Wendl MC, Wyczalkowski MA, et al. Divergent viral presentation among human tumors and adjacent normal tissues[J]. Sci Rep, 2016,6:28294.

[25] Tamori A, Yamanishi Y, Kawashima S, et al. Alteration of gene expression in human hepatocellular carcinoma with integrated hepatitis B virus DNA[J]. Clin Cancer Res, 2005,11(16):5821-5826.

[26] Pang Y, Guo W, Wang J, et al. Gene copy number variations in the leukocyte genome of hepatocellular carcinoma patients with integrated hepatitis B virus DNA[J]. Oncotarget, 2016,7(7):8006-8018.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.42.034

R735

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2017-06-21)