尋常型銀屑病皮損組織中miR-138、hTERT、K17的表達及意義

馮世軍，李華蕊，張廣靜，王正想，楊秀芳

(滄州市中心醫院，河北滄州061001)

尋常型銀屑病皮損組織中miR-138、hTERT、K17的表達及意義

馮世軍，李華蕊，張廣靜，王正想，楊秀芳

(滄州市中心醫院，河北滄州061001)

目的觀察尋常型銀屑病皮損組織中miR-138、hTERT、K17的表達，分析三者之間的相互關系。方法選擇28例尋常型銀屑病患者(觀察組)和24例健康對照者(對照組)，取其皮膚組織，采用實時熒光定量PCR法檢測miR-138表達，Western blotting法檢測hTERT、K17蛋白表達。采用Pearson相關分析miR-138與hTERT、K17及hTERT與K17表達水平的相關性。結果與對照組相比，觀察組皮損組織中miR-138表達降低，hTERT、K17蛋白表達升高(P均<0.05)。miR-138表達與hTERT、K17表達均呈負相關(r=-0.623、-0.789，P均<0.01)，hTERT與K17表達呈正相關(r=0.683，P<0.01)。結論尋常型銀屑病皮損組織中miR-138表達降低，hTERT、K17蛋白表達升高；miR-138可能參與角質形成細胞的異常增殖，通過靶向調節hTERT而上調K17蛋白的表達。

尋常型銀屑病;微小RNA；人端粒酶逆轉錄酶；K17

銀屑病是由T細胞介導的慢性炎癥性皮膚病，其中以尋常型銀屑病最為多見。目前銀屑病的病因和發病機制尚不清楚，可能與遺傳因素、環境因素、免疫、新生血管、脂代謝紊亂、心態等有關[1]。據報道，銀屑病的一般治療方法為局部紫外線照射、甲氨蝶呤、環孢素A、阿曲汀和生物制劑治療[2]。隨著研究的深入，細胞因子、信號分子和微小RNA(miRNA)逐漸成為尋常型銀屑病的潛在治療靶點[3，4]。miRNA結合于mRNA的UTR區，能夠通過加速轉錄過程或miRNA轉錄產物的降解過程而抑制翻譯進程[5]。miRNA的異常表達與腫瘤、心血管疾病和炎癥性疾病等[6]的發生有關。最近關于某些特異性miRNA在銀屑病中的作用也逐漸受到關注，如hsa-miR-99a、miR-146a、miR-486-3p、miR-155、miR-203和miR-125b[4，7]。作為miRNA家族的一員，miR-138通過調節靶標基因參與腫瘤轉移和分化、DNA損傷和細胞衰老等一系列生理反應[8]，以往研究表明，miR-138的過量表達能夠降低人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)蛋白的表達，從而調節端粒酶在多種腫瘤中的活性，如惡性成神經細胞瘤、甲狀腺癌和子宮頸癌。K17屬于Ⅰ型上皮角質素(酸性)，通過向角質形成細胞提供機械支持保護表皮的完整性[6]。然而，miR-138與hTERT、K17在尋常型銀屑病中的表達變化及意義目前尚不明確。本研究通過觀察尋常型銀屑病皮膚組織中miR-138、hTERT、K17的表達，進一步分析三者之間的相互關系，以期為尋常型銀屑病尋找新的治療靶點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2015年6月～2017年1月我院收治的28例尋常型銀屑病患者(觀察組)，其中男15例、女13例，平均年齡31.4歲。入選標準：①病理診斷為尋常型銀屑病；②3個月內未服用免疫抑制劑、糖皮質激素和維甲酸等藥物；③1個月內無尋常型銀屑病外用藥物或光照治療；④無其他皮膚病、自體免疫性疾病、腫瘤或其他嚴重疾病；⑤患者非妊娠期、哺乳期或月經期。對照組為我院燒傷科收治的24例患者，其中男11例、女13例，平均年齡32.2歲?；颊呔鶡o銀屑病史及家族史，無其他自身免疫性疾病，無腫瘤或其他嚴重疾病。兩組性別、年齡具有可比性。本研究獲得我院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 miR-138檢測 采用實時熒光定量PCR法。收集患者的皮膚組織，加入液氮研磨，使用RNA提取試劑盒(Qiagen)提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度，控制OD260/280在1.7～2.1。將RNA反轉錄成cDNA，于ABI7500進行qRT-PCR反應。PCR條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 34 s，共40個循環。miR-138上游引物5′-GGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3′，下游引物5′-AACTTCACAACACCAGCTTA-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA -3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6基因為內參，根據內參基因繪制標準曲線，計算目的基因的相對表達量。

1.3 hTERT、K17蛋白檢測 采用Western blotting法。收集患者的皮膚組織，以中性蛋白酶處理，4 ℃過夜，充分研磨處理后，加入細胞蛋白裂解液，離心取上清液，應用BCA試劑盒測定蛋白濃度，煮沸5～10 min后，-20 ℃凍存。SDS-PAGE蛋白電泳后轉移至PVDF膜，封膜后加入兔抗人和鼠抗人K17抗體，4 ℃過夜，加入HRP標記的羊抗兔IgG抗體和HRP標記的兔抗鼠IgG抗體，37 ℃孵育1 h，一抗和二抗均購自Santa Cruz Biotechnology。以GAPDH為內參進行化學發光成像，以目的蛋白占內參蛋白的百分比計算目的蛋白相對濃度。

2 結果

2.1 兩組皮膚組織中miR-138表達比較 觀察組和對照組皮膚組織中miR-138的相對表達量分別為1.12±0.24、2.08±0.31，觀察組miR-138表達低于對照組(P<0.05)。

2.2 兩組皮膚組織中hTERT、K17蛋白表達比較 觀察組hTERT、K17的表達量分別為0.78±0.11和0.67±0.12，對照組分別為0.34±0.06、0.28±0.04。觀察組hTERT、K17蛋白表達高于對照組(P均<0.05)。

2.3 miR-138與hTERT、K17蛋白表達的相關性 miR-138表達與hTERT、K17表達均呈負相關(r=-0.623、-0.789，P均<0.01)，hTERT與K17表達呈正相關(r=0.683，P<0.01)。

3 討論

miRNA是一種長約22個核苷酸的非蛋白質編碼的小分子RNA，在轉錄后水平調節蛋白質編碼基因的表達。miRNA是細胞生長、增殖、分化、凋亡和信號轉導的關鍵調節物質，參與免疫系統的調節以及慢性炎癥反應的發病機制，其表達的改變會導致疾病的發生。銀屑病是具有遺傳易感性的個體在內外環境的共同作用下，由T細胞介導的常見慢性復發性炎癥性皮膚病。以往研究發現，多種miRNA參與銀屑病的發病機制，包括miR-203、miR-146、miR-125b、miR-21、miR-221、miR-222以及miR-155等[9]，這些miRNA在銀屑病皮損組織中呈非正常表達模式，不同程度地參與銀屑病角質形成細胞的增殖、分化和凋亡。本研究結果顯示，觀察組皮損組織中miR-138表達低于對照組，表明miR-138可能與同一家族中其他miRNA成員共同參與了銀屑病的發生發展過程。

研究表明，銀屑病皮損處表皮角質形成細胞中hTERT的表達水平顯著增高，提示銀屑病皮損中hTERT活性增加可能與銀屑病發病有關[10]。hTERT mRNA只在惡性腫瘤組織及某些有高度再生潛力的組織如銀屑病中表達，與端粒酶活性表達一致，被認為是端粒酶活性的決定因素。以往研究顯示，在銀屑病皮損處可以檢測到較高水平的端粒酶表達，而正常皮膚則不表達或表達低水平的端粒酶活性，說明端粒酶可能參與細胞的增殖調控。本研究表明miR-138在銀屑病皮損中的低表達與hTERT呈負相關，推測hTERT的表達上調導致端粒酶活性升高，促進角質形成細胞的異常增殖，從而參與銀屑病的發生發展進程。

K17被認為是“銀屑病相關性細胞角蛋白”，與鏈球菌M蛋白具有相同的序列ALEEAN，可特異性刺激銀屑病T細胞，使之活化、釋放IFN-γ等炎癥因子，而IFN-γ又能夠經STAT1信號通路上調K17表達，使機體產生針對K17的自身免疫反應，從而形成一個惡性環路，導致炎癥反應和角質形成細胞異常增生等病理改變，成為銀屑病發病過程中的關鍵環節。因K17在銀屑病皮損中呈高表達以及其具有刺激T細胞活化的作用，被界定為銀屑病自身反應性T細胞識別的候選靶抗原。以往研究證實，在銀屑病的病理過程中存在“K17-T細胞-細胞因子環路”，該環路可能是銀屑病皮損持續存在和反復發作的重要基礎[11，12]。近年來，許多學者也在不斷嘗試研究以K17作為靶點治療銀屑病的方法。本研究表明，miR-138與K17的表達呈負相關，結合miR-138在銀屑病皮損中的表達低于正常皮膚組織，我們推測miR-138在銀屑病皮損中的低表達引起K17表達升高，從而促進銀屑病的發生發展，如果能夠利用miRNA藥物來抑制K17表達，可能起到治療和緩解銀屑病的目的。孫中斌等[7]研究證實，miR-486-3p在銀屑病皮損中通過K17 3′UTR種子序列結合抑制K17表達，說明miRNA對K17的調控作用參與銀屑病的發生和發展。

hTERT表達與K17呈正相關，然而關于二者之間相互作用的機制尚不清楚。K17在銀屑病皮損中的高表達刺激T細胞分泌IFN-γ，IFN-γ對細胞的刺激可以引起STAT蛋白聚集到IFNγR Ⅰ受體鏈的單個STAT結合位點上，進而可被JAK1/JAK2激活，之后STAT從受體上游離、形成二聚體，進入細胞核內，與干擾素激活部位增強子家族結合，參與信號轉導。JAK-STAT信號通路在多種疾病的病理改變中均扮演著重要角色，研究表明STAT3可以通過結合在TERT啟動子特定位點引起TERT表達升高[13]。因此我們推測，銀屑病皮損中K17表達升高促使細胞分泌IFN-γ和IL-2增多，進而激活JAK-STAT信號通路，從而上調hTERT的表達。

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