右美托咪定預處理對異丙酚誘導發育期大鼠離體海馬神經細胞損傷的影響

楊劍，劉婷婷，熊興龍，嚴莉，劉婉玲

(1貴州醫科大學附屬醫院，貴陽550004；2貴州醫科大學附屬白云醫院)

·基礎研究·

右美托咪定預處理對異丙酚誘導發育期大鼠離體海馬神經細胞損傷的影響

楊劍1，劉婷婷1，熊興龍1，嚴莉2，劉婉玲1

(1貴州醫科大學附屬醫院，貴陽550004；2貴州醫科大學附屬白云醫院)

目的觀察右美托咪定預處理對異丙酚誘導的發育期大鼠離體海馬神經細胞損傷的影響。方法體外培養新生SD大鼠海馬神經細胞，按隨機數字表法分為對照組、異丙酚組、右美托咪定預處理組。對照組正常培養12 h；異丙酚組在培養液中加入12 μg/mL異丙酚孵育12 h；右美托咪定預處理組下設5個濃度組，分別加入0.002 5、0.025、0.25、2.5、25 μg/mL右美托咪定預處理30 min，再加入12 μg/mL異丙酚繼續孵育12 h。采用MTT法檢測海馬神經細胞存活率、HE染色光鏡下觀察海馬神經細胞形態學變化。結果與對照組比較，異丙酚組、右美托咪定預處理組神經細胞存活率均降低(P<0.05或<0.01)；與異丙酚組比較，右美托咪定預處理組神經細胞存活率均升高(P<0.05或<0.01)，右美托咪定濃度較高組的神經細胞存活率高于右美托咪定濃度較低組(P均<0.05)。對照組神經細胞形態正常；異丙酚組出現明顯的神經細胞損傷，細胞體積變小，胞質呈空泡樣改變，胞核固縮深染；右美托咪定預處理組神經細胞損傷程度較異丙酚組減輕，隨右美托咪定濃度的增高，神經細胞損傷程度逐漸減輕，其中2.5、25 μg/mL右美托咪定預處理的海馬神經細胞更接近于正常細胞，受損細胞數目明顯減少。結論0.002 5～25 μg/mL的右美托咪定預處理可減輕異丙酚誘導的發育期大鼠離體海馬神經細胞損傷。

右美托咪定；預處理；異丙酚；發育期神經系統；神經細胞損傷；大鼠

嬰幼兒時期全身各系統尤其是大腦處于快速發育、成熟的階段。全身麻醉藥對嬰幼兒發育期神經系統的影響一直廣受關注。研究表明，異丙酚可導致未成年大鼠腦神經系統受損，使發育期神經系統出現神經細胞退行性改變，并且其影響可持續至成年[1]。右美托咪定為α2腎上腺素能受體激動劑，具有鎮靜、鎮痛等作用。近年研究發現，右美托咪定具有器官保護及腦神經保護作用[2]，可減輕七氟烷等吸入麻醉藥誘導的發育期大鼠神經毒性[3，4]。關于右美托咪定對異丙酚誘導的發育期大鼠離體海馬神經細胞損傷的影響少見報道。2014年3月～2015年3月，我們通過體外培養大鼠海馬神經細胞，給予不同濃度的右美托咪定預處理，觀察其能否減輕異丙酚引起的發育期大鼠離體海馬神經細胞損傷，為臨床小兒麻醉合理用藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 健康7日齡SD大鼠140只，體質量12～16 g，雌雄不限，由貴州醫科大學實驗動物中心提供。DMED/F12培養基500 mL(GIB-CO公司)，胎牛血清(貴州鼎國生物科技有限責任公司)，胰蛋白酶(Worthington公司，美國)；異丙酚中/長鏈脂肪乳注射液(Fresenius Kabi公司，德國)，鹽酸右旋美托咪定(江蘇恒瑞藥業有限公司)，MTT(上海譜振生物科技有限公司)。

1.2 海馬神經細胞的分離與培養 大鼠斷頸處死，置冰盤上，在解剖顯微鏡下分離腦組織，于視交叉后1～2 mm沿冠狀面取海馬組織標本，置于預冷的PBS液中并清洗。用剪刀剪碎腦組織，加入0.125%胰酶消化2 min，加入含10%胎牛血清的DMED/F12培養基終止胰酶反應。200目濾網過濾、離心，加入新鮮培養基吹勻制成單細胞懸液。胎盤藍染色進行細胞計數，將海馬神經細胞按照2×105～3×105/mL接種于6孔板、96孔板及50 mL培養瓶中。37 ℃、5% CO2培養箱內培養。48 h后全量換液，以后每2天全量換液1次，相差顯微鏡定期觀察神經細胞的生長情況。

1.3 海馬神經細胞的鑒定 采用神經元特異性烯醇化酶(NSE)免疫熒光染色法。細胞培養至第7天，棄去培養基，用溫育的PBS液沖洗細胞2次，4%多聚甲醛室溫條件下固定15 min。PBS沖洗，在4 ℃條件下用0.1% Triton-X-100透膜15 min。PBS沖洗，4% BSA室溫封閉30 min。用稀釋后的NSE一抗(1∶100)在4 ℃冰箱中孵育過夜，PBS沖洗，37 ℃條件下加入二抗(1∶100)孵育1 h。最后用PBS沖洗3次，DAPI染細胞核并用熒光顯微鏡拍照。海馬神經細胞胞質染色呈綠色，細胞核呈藍色，細胞形態呈樹突狀生長。

1.4 細胞分組與處理 將體外原代培養的海馬神經細胞隨機分為對照組、異丙酚組、右美托咪定預處理組。對照組正常培養；異丙酚組培養至第7天時，加入12 μg/mL異丙酚繼續孵育12 h；右美托咪定預處理組下設5個濃度組，分別加入0.002 5、0.025、0.25、2.5、25 μg/mL右美托咪定預處理30 min后，再加入12 μg/mL異丙酚繼續孵育12 h。每組設6個復孔。

1.5 海馬神經細胞存活率檢測 采用MTT法。取各組細胞加入MTT 20 μL/孔，置于CO2培養箱中孵育4 h，棄上清，加入DMSO 150 μL/孔，置于酶標儀上，在490 nm波長下檢測各孔的吸光度OD值。

1.6 海馬神經細胞形態學觀察 采用HE染色法。超凈臺中操作，取6孔培養板，用移液器在每孔內滴加一滴PBS液，將蓋玻片放入，再用移液器將制備好的細胞懸液滴在蓋玻片上，于上述培養箱內培養，讓生長的細胞自然附著貼壁于玻片，制成細胞爬片。取蓋玻片(細胞面朝上)，蘇木精染色4 min，蒸餾水漂洗，1%鹽酸乙醇分色數秒立刻水洗，碳酸鋰返藍；0.5%伊紅染色，蒸餾水漂洗，95%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片固定。光學顯微鏡下觀察細胞形態學特點。

2 結果

2.1 各組海馬神經細胞存活率比較 對照組、異丙酚組的神經細胞存活率分別為92.93%±0.12%、24.37%±0.07%，右美托咪定預處理組加入0.002 5、0.025、0.25、2.5、25 μg/mL右美托咪定預處理后的神經細胞存活率分別為39.95%±0.11%、52.04%±0.14%、57.18%±0.34%、61.70%±0.25%、74.93%±0.12%。與對照組比較，異丙酚組、右美托咪定預處理組神經細胞存活率均降低(P<0.05或<0.01)。與異丙酚組比較，右美托咪定預處理組神經細胞存活率均升高(P<0.05或<0.01)。右美托咪定濃度較高組的神經細胞存活率高于濃度較低組(P均<0.05)。

2.2 各組海馬神經細胞形態學變化比較 對照組細胞形態基本正常，胞體飽滿較大，軸突清晰，胞質均勻，折光性強有明顯的立體感，大多數細胞呈錐形體、雙極、三角形或不規則形，多極突起交織成網狀并形成神經細胞網絡支撐物。異丙酚組出現明顯的神經細胞損傷，細胞體積變小、胞質不均勻，空泡樣改變，胞核固縮深染，細胞間網絡結構被破壞。右美托咪定預處理組加入0.002 5、0.025、0.25 μg/mL右美托咪定預處理后，細胞損傷程度減輕，固縮深染的細胞核數量減少，2.5、25 μg/mL右美托咪定預處理后的神經細胞更接近于正常細胞，軸突較清晰，體積變小的細胞及固縮深染的細胞核數目明顯減少。

3 討論

異丙酚是臨床小兒全身麻醉中常用的靜脈麻醉藥。異丙酚的主要效應靶點為GABA受體，通過激動GABA受體降低興奮性突觸傳遞而產生全麻作用。Jin等[5]報道，在腦發育高峰期，過度激動的GABA受體可導致神經細胞凋亡，并引起遠期學習記憶缺陷。我們的前期研究[6]證實，12 μg/mL異丙酚作用24 h可引起發育期大鼠離體海馬神經細胞顯著凋亡；另有研究[7，8]證實，異丙酚可對發育期大鼠神經細胞產生損害作用，作用于不同神經通路導致突觸可塑性改變，損害其認知及記憶功能。右美托咪定為高選擇性激動α2腎上腺素能受體，具有良好的鎮靜、鎮痛效果，目前逐步應用于小兒臨床麻醉及ICU鎮靜中[9]。邑俊華等[10]報道，0.01～100 μmol/L右美托咪定預處理可減輕甚至逆轉異丙酚對胎鼠的神經毒性作用。另有研究[3，11]顯示，右美托咪定能改善不同全身麻醉藥誘導的發育期大鼠神經損害。在大腦皮質損傷過程中，右美托咪定可以抑制神經細胞凋亡[12]。

海馬是腦內學習記憶形成、發生的重要結構，其對不良刺激造成的損傷最為敏感。嚙齒類動物的大腦發育高峰期出現于出生后7 d[8]，此時期腦內神經細胞及突觸等神經結構快速發育，同時也是大腦最易受損的時期。因此本研究選擇7日齡的發育期大鼠作為研究對象，將其海馬神經細胞離體培養至第7天(生長狀態最活躍)，然后進行藥物處理。結果顯示，異丙酚組神經細胞存活率明顯降低，光鏡下可見海馬神經細胞損傷明顯；而加入0.002 5、0.025、0.25、2.5、25 μg/mL右美托咪定預處理后再加入異丙酚，海馬神經細胞存活率升高，海馬神經細胞損傷程度減輕。提示右美托咪定預處理能夠減輕異丙酚誘導的發育期大鼠離體海馬神經細胞損傷，且濃度較高組的效果更佳。葛東健等[13]報道，右美托咪定可減輕利多卡因誘發大鼠大腦皮層神經細胞凋亡，本研究結果與其相符。

綜上所述，在0.002 5～25 μg/mL范圍內，右美托咪定預處理能夠減輕異丙酚對發育期大鼠離體海馬神經細胞的損傷作用。本研究目前僅限于離體海馬神經細胞體外培養，后續我們將通過動物模型實驗，進一步研究右美托咪定對異丙酚誘導的發育期大鼠遠期學習記憶障礙的影響。

[1] Yu D, Jiang Y, Gao J, et al.Repeated exposure to propofol potentiates neuroapoptosis and long-term behavioral deficits in neonatal rats[J]. Neuroscience Letters, 2013,534(8):41-46.

[2] 蘭琛.右美托咪定對大鼠腦缺血再灌注后神經細胞凋亡的影響[J].山東醫藥,2016,56(22):39-40.

[3] Liao Z, Cao D, Han X, et al. Both JNK and P38 MAPK pathways participate in the protection by dexmedetomidine against isoflurane-induced neuroapoptosis in the hippocampus of neonatal rats[J]. Brain Res Bull, 2014,107(8):69-78.

[4] Wang WY, Wang H, Luo Y, et al. The effects of metabotropic glutamate receptor 7 allosteric agonist N,N′-dibenzhydrylethane-1, 2-diamine dihydrochloride on developmental sevoflurane neurotoxicity: role of extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 mitogen-activated protein kinase signaling pathway[J]. Neuroscience, 2012,205(3):167-177.

[5] Jin HL, Zhang J, Wei L, et al. Neurodevelopmental implications of the general anesthesia in neonate and infants[J]. Experimental Neurology, 2015,272(10):50-60.

[6] 楊劍,嚴莉,高鴻,等.不同濃度異丙酚對新生大鼠離體海馬神經元凋亡的影響[J].中華麻醉學雜志,2012,32(11):1350-1352.

[7] Pearn ML, Hu Y, Niesman IR, et al. Propofol neurotoxicity is mediated by p75 neurotrophin receptor activation[J]. Anesthesiology, 2012,116(2):352-361.

[8] 賀丹,陶虓嫣,廖淳杰,等.異丙酚麻醉對新生大鼠海馬PKA-CREB信號通路的影響[J].中華麻醉學雜志,2013,33(10):1198-1201.

[9] 趙燕,高巨,林舜艷,等.右美托咪定術前滴鼻對全麻患兒術后行為改變的影響[J].臨床麻醉學雜志,2016,32(3):222-225.

[10] 邑俊華,梁羽冰,覃怡,等.右美托咪定預處理對異丙酚孵育的大鼠海馬神經元細胞活力的影響[J].臨床麻醉學雜志,2013,29(5):488-490.

[11] Duan X, Li Y, Zhou C, Huang L, et al. Dexmedetomidine provides neuroprotection: impact on ketamine-induced neuroapoptosis in the developing rat brain[J]. Acta Anaesthesiol Scand, 2014,58(9):1121-1126.

[12] Rodríguez-González R, Sobrino T, Veiga S, et al. Neuroprotective effects of dexmedetomidine conditioning strategies: Evidences from an in vitro model of cerebral ischemia[J]. Life Sciences, 2016,144(1):162-169.

[13] 葛東健,祁賓,李金玉,等.右美托咪定對利多卡因誘發大鼠皮層神經元凋亡的影響[J].中華麻醉學雜志,2013,33(9):1079-1081.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.42.008

R741

A

1002-266X(2017)42-0029-03

貴州省科技計劃課題(黔科合LH字2014-7119)。

2017-03-17)