兔膝關節開放性海水浸泡損傷模型的構建

李文，曾國慶，陳愛寶，楊學洪，穆繼宏

(中國人民解放軍第425醫院骨科，海南 三亞572008)

兔膝關節開放性海水浸泡損傷模型的構建

李文，曾國慶，陳愛寶，楊學洪，穆繼宏

(中國人民解放軍第425醫院骨科，海南 三亞572008)

目的 探索并構建理想的兔膝關節開放性海水浸泡損傷的動物模型。方法 取新西蘭白兔60只，建立兔膝關節開放性損傷模型，按照不同的海水浸泡時間分為對照組、0.5 h組、1 h組、3 h組和6 h組，每組各12只。對照組不予處理，各實驗組制備膝關節開放性傷口，分別給予相應的海水浸泡時間。術后觀察實驗動物傷口及存活情況，于術后7 d抽取各組白兔膝關節液，采用酶聯免疫吸附法檢測關節液中炎性因子白細胞介素1-β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。結果3 h組和6 h組的7 d存活率分別為91.7%、75.0%，其余各組均為100.0%；1 h組、3 h組和6 h組的14 d存活率分別為91.7%、83.3%和58.3%，其余各組均為100.0%。術后7 d，3 h組和6 h組中關節液IL-1β水平分別為(37.50±6.1)pg/mL和(38.40±5.1)pg/mL，明顯高于其他各組，差異均有統計學意義(P＞0.05)，而3 h組和6 h組中關節液IL-1β水平比較差異無統計學意義(P＞0.05)；術后7 d，1 h組和3 h組關節液中的TNF-α水平分別為(297.48±35.7)pg/mL和(312.84±34.0)pg/mL，高于0.5 h組和對照組，低于6 h組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，而1 h組和3 h組關節液中的TNF-α水平比較差異無統計學意義(P＞0.05)。結論 海水浸泡3 h構建兔膝關節海水浸泡損傷的動物模型具有動物存活率高、炎性反應活躍等特點，是一種理想的關節開放性海水浸泡損傷的動物模型。

膝關節；海水浸泡；動物模型；兔

隨著人們對海洋的不斷認識和探索，海水浸泡損傷在戰創傷中所占的比例不斷增大。本實驗的目的是建立合理的膝關節開放性海水浸泡損傷動物模型，了解動物模型的病理機制，提高關節海水浸泡傷的臨床處理水平。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取普通新西蘭白兔60只，體質量(2.4±0.2)kg，雌雄不限。全部實驗動物隨機分為五組，每組12只。其中4組按膝關節外傷后海水浸泡時間分為0.5 h組、1 h組、3 h組和6 h組，另1組實驗動物不予如何處理，作為對照組。

1.2 實驗模型的制備 各實驗組白兔按0.l mL/kg給予速眠新肌注麻醉，四肢固定在實驗臺上，單側膝關節去毛，常規消毒、鋪單。沿髕旁內側做約2.5cm的橫行切口，逐層切開至關節囊，直至關節腔，暴露關節軟骨面。在自然天氣情況下將各組家兔患膝傷口在海水中分別浸泡0.5h、1h、3h和6h，浸泡結束后用無菌生理鹽水沖洗關節腔，依次縫合傷口。對照組白兔不予處理。術后全部實驗動物按常規分籠喂養。

1.3 檢測指標

1.3.1 臨床觀察 大體觀察實驗動物的傷口情況、關節活動度等，比較各組間術后7 d和14 d的生存率。

1.3.2 關節液炎性因子指標 于術后第7天按相同方式麻醉、消毒，采用注射器于膝關節外側間隙向關節腔內注射1.0mL無菌生理鹽水，待充分混勻后抽取1.0mL關節液備用。樣本置于離心管中，1 500r/min離心20min，-70℃保存待測。采用ELISA試劑盒檢測各樣本中白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子(TNF-α)的水平。

2 結果

2.1 術后7 d和14 d各組白兔的生存率比較 全部實驗動物術后第1天均能站立，傷口無明顯滲出，局部皮膚無紅腫。術后第3天，3 h組和6 h組部分實驗動物患膝出現腫脹，局部皮溫高，傷口無明顯滲出。術后第5天，1 h組1例實驗動物患膝出現紅腫，皮溫稍高。術后14 d臨床觀察，存活的實驗動物中，僅6 h組出現1例傷口不愈合，見表1。

表1 術后7 d和14 d各組生存率比較[只(%)]

2.2 術后7 d各組白兔關節液中IL-1β和TNF-α的水平 術后7 d，各組兔膝關節液中IL-1β和TNF-α的水平比較差異均有統計學意義(P＜0.05)。3 h組和6 h組的IL-1β水平明顯高于0.5 h組和1 h組(P＜0.05)，且0.5 h組和1 h組的IL-1β水平高于對照組(P＜0.05)；此外，6 h組的TNF-α水平明顯高于1 h組和3 h組(P＜0.05)，且1 h組和3 h組的TNF-α水平明顯高于對照組和0.5 h組。這表明長時間的海水浸泡容易引發更嚴重的炎癥反應，見表2。

表2 術后7 d各組白兔膝關節液IL-1β和TNF-α水平比較(±s，pg/mL)

表2 術后7 d各組白兔膝關節液IL-1β和TNF-α水平比較(±s，pg/mL)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與0.5 h組比較，bP＜0.05；與1 h組比較，cP＜0.05；與3 h組比較，dP＜0.05。

組別對照組0.5 h組1 h組3 h組6 h組F值P值只數12 12 12 11 9 IL-1β 25.49±2.8 30.21±5.8a31.58±4.7a37.50±6.1abc38.40±5.1abc13.694＜0.05 TNF-α 252.00±57.9 254.77±38.1 297.48±35.7ab312.84±34.0ab353.62±32.3abcd13.100＜0.05

3 討論

海水是一種較為復雜的致傷因素，當機體出現開放性損傷，海水浸泡將加重創傷后機體的病理生理改變，從而導致不同的預后及治療方案[1-2]。由于關節內的組織結構復雜，且軟骨、滑膜等組織自愈能力欠佳，故建立合適的關節內海水浸泡傷動物模型將有助于了解其病理改變，提供合理的臨床治療方案。

有學者研究證明，高滲液體可刺激單核細胞內炎性介質基因的表達[3]。發生海水浸泡傷后，與創傷愈合的相關蛋白早期表達減弱以及機體對海水中致病菌的暴露，都可能是影響組織愈合的因素[4-5]。林建寧等[6]觀察了家兔海水浸泡開放性骨折的特點，發現海水浸泡使傷口的感染率增高，骨折愈合的滿意率下降，骨痂形成不良率增高，骨折愈合過程延遲[7]。筆者假設海水浸泡對膝關節開放性損傷產生重要的影響，在關節及全身感染率、關節內組織不可逆損傷、關節液中炎性因子的表達等方面發揮作用，那么通過比較不同海水浸泡時間的差別，可以總結出致死率低、關節內炎性改變明顯的兔膝關節海水浸泡傷模型。

本實驗發現，海水浸泡6 h的動物模型生存率相對較低，傷口周圍炎性反應較其他各組明顯。這可能與關節內和全身感染相關，全身性炎癥反應致多器官功能障礙。盡管此組動物模型能夠提供足夠嚴重的關節損傷，但造模過程中實驗動物的損失較多，造模失敗率及經濟損傷過大；相對而言，0.5 h、1 h和3 h組的實驗動物具有更高的存活率。

關節液中炎性因子的水平可以間接反映關節內炎癥反應的程度，動物實驗發現，海水浸泡可以使損傷組織內的炎性因子含量升高并參與組織繼發損傷，TNF-α、白介素-8(IL-8)、NO的含量在浸泡后3～36 h內明顯較單純損傷高[8]。本研究發現，術后7 d，1 h、3 h和6 h組的兔膝關節液中IL-1β和TNF-α的水平均高于對照組，表明海水浸泡損傷是兔膝關節炎性反應較為敏感的致傷因素。同時，海水浸泡0.5 h和1 h的實驗動物關節液中IL-1β水平明顯低于3 h和6 h組；海水浸泡1 h和3 h的實驗動物關節液中TNF-α的水平明顯低于6 h組，說明海水浸泡時間會影響關節液中炎性因子的水平。從實驗結果看出，1 h、3 h及6 h的海水浸泡時間均能夠造成兔海水浸泡傷模型膝關節的炎性反應，浸泡時間越長，炎性因子水平升高越明顯。長時間的海水浸泡使關節組織內的滲透壓改變，合并特殊致病菌感染等因素，發生一系列病理生理改變，大量炎性因子介入，最終導致關節內不可逆的組織損傷[9]。

海水浸泡致膝關節損傷的作用機制十分復雜，本研究的造模過程未能納入關節損傷和海水浸泡傷的全部致傷因素，如低體溫、復合損傷、關節內骨折等。這些因素能夠在不同程度上改變損傷的進程，隨著研究的深入，尚需進一步的實驗逐步完善此動物模型。

綜上所述，采用1 h、3 h及6 h海水浸泡兔膝關節的造模方法可以提高關節液中的炎性因子水平，但6 h海水浸泡的實驗動物存活率較低，因而1 h和3 h的海水浸泡時間可以滿足兔膝關節海水浸泡損傷的造模需要，而3 h的浸泡時間更容易引發造模所需的炎癥反應。該兔膝關節海水浸泡損傷模型可應用于進一步研究，在損傷分型、病理改變和早期救治等方面發揮作用。

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[3]Shapiro L,Dinarello CA.Hyperosmotic stress as stimulant for proinflammatory cytokine production[J].Exp Cell Res,1997,231(2): 354-362.

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[6]林建寧,阮狄克,楊偉志.模擬海水浸泡開放骨折的實驗研究[J].中華航海醫學與高氣壓醫學雜志,2006,13(3):140-142.

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Establishment of a rabbit model of seawater immersion after knee injury.

LI Wen,ZENG Guo-qing,CHEN Ai-bao, YANG Xue-hong,MU Ji-hong.Department of Orthopedics,the 425thHospital of Chinese PLA,Sanya 572008,Hainan, CHINA

ObjectiveTo explore and construct a rabbit model of seawater immersion after knee injury. MethodsSixty rabbits of knee injury were randomly divided into five groups:control group,0.5 h group,1 h group, 3 h group and 6 h group.The control group was subjected to simple knee injury,and other groups received seawater immersion of different duration respectively.The wound and survival was observed.After 7 days,the content of interleukin-1 β(IL-1 β)and tumor necrosis factor-α(TNF-α)in the synovial fluid in each group was measured by enzyme-linked immunosorbent assay.ResultsThe 7-d survival rate was 91.7%in 3 h group,75.0%in 6 h group,and 100.0%in other groups.The 14-d survival rate was 91.7%in 1 h group,83.3%in 3 h group,58.3%in 6 h group,and 100.0%in other groups.Seven days after treatment,the IL-1β levels of synovial fluid in 3 h group and 6 h group showed no statistically significant difference,which were(37.50±6.1)pg/mL and(38.40±5.1)pg/mL,but they were significantly higher than those in other groups.Seven days after treatment,the TNF-α content of synovial fluid in 1 h group and 3 h group,(297.48±35.7)pg/mLand(312.84±34.0)pg/mL respectively,were significantly higher than that in 0.5 h group and control group but lower than that in 6 h group(P＜0.05).ConclusionThe models of seawater immersion for 3 hours after knee injury have higher survival rate and more inflammatory reactions,which are recommended.

Knee;Seawater immersion;Animal model;Rabbits

R-332

A

1003—6350（2017）02—0183—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.02.004

2016-07-07)

海南省三亞市醫療衛生科技創新項目（編號：2014YW47）

穆繼宏。E-mail：mu.jihong@hotmail.com