高銅對(duì)于肝細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響☆

黃雅楠李海董健健程楠韓詠竹○☆

Wilson病(Wilson’s disease,WD)，是ATP7b基因突變[1]，引起的銅代謝障礙[2]。并導(dǎo)致過量的銅在臟器中沉積，主要影響腦和肝臟[3]，嚴(yán)重者可危及生命。Wnt/β-catenin這條信號(hào)通路不僅對(duì)調(diào)控肝臟的正常生理，如肝臟的再生以及代謝等而且也參與了各種肝臟的疾病，如肝癌，肝纖維化等[5]，在正常情況下，Wnt信號(hào)通路對(duì)保護(hù)肝細(xì)胞的損傷有重要的作用，而過度激活的Wnt信號(hào)通路可能導(dǎo)致肝細(xì)胞纖維化。目前對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的研究越來越多，對(duì)肝臟的康復(fù)有不可替代的作用，該條信號(hào)通路對(duì)肝臟來說是非常重要的。本研究擬探討Wnt/β-catenin信號(hào)通路在高銅損傷肝細(xì)胞模型中的作用機(jī)制，在分子水平闡明Wnt/β-catenin信號(hào)通路在WD發(fā)病過程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)將BRL-3A細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫)培養(yǎng)基為10%胎牛血清的1640（美國(guó)Gibco公司），放在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d傳代一次。

1.2 MTT法測(cè)不同劑量CuSO4作用不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)BRL-3A細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的影響。細(xì)胞以每孔1×104個(gè)接種于96孔板中，實(shí)驗(yàn)組分別加入Cu-SO4終濃度為25 μM、50 μM、100 μM、200 μM、400 μM、800 μM、1600 μM溶液，正常對(duì)照組加無FBS培養(yǎng)基，空白組加PBS，分別培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h后，每孔加MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加150 μL的DMSO，搖床振蕩，用酶標(biāo)儀檢測(cè)，計(jì)算平均半數(shù)抑制濃度（IC50)。

1.3 流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS和JC-1的變化。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BRL-3A細(xì)胞，收集細(xì)胞，PBS洗2遍，ROS檢測(cè)分組為空白組，150 μM，300 μM，500 μM，600 μM，分別加入DA標(biāo)記的H2DCF，培養(yǎng)箱孵育20 min且每5 min搖勻一次。JC-1檢測(cè)分組為空白組，100 μM，200 μM，400 μM，500 μM加入JC-1熒光探針，放培養(yǎng)箱孵育15 min，過濾加入流式管，上機(jī)檢測(cè)。

1.4 酶標(biāo)儀檢測(cè)MDA含量和T-SOD活性按照試劑盒要求配制所……