流式細胞儀在放射生物學實驗教學中的應用

吳安慶, 聶 晶, 裴海龍, 張 健, 周光明

(蘇州大學 放射醫學與防護學院, 江蘇 蘇州 215123)

流式細胞儀在放射生物學實驗教學中的應用

吳安慶, 聶 晶, 裴海龍, 張 健, 周光明

(蘇州大學 放射醫學與防護學院, 江蘇 蘇州 215123)

根據放射醫學專業的實驗教學特點,開設了第二課堂講述流式細胞術的原理和應用,并設計了使用流式細胞儀檢測X射線照射后腫瘤細胞的凋亡和周期的實驗課。同時,每個星期安排固定時間讓學生練習操作,熟練掌握流式細胞儀,加強學生對理論知識的理解,提高學生的科研興趣和動手能力。

流式細胞儀； 放射生物學； 實驗教學

流式細胞術是利用流式細胞儀對處在快速、 直線、流動狀態中的單個細胞或生物顆粒逐個進行多參數、快速定量分析和分選的技術[1]?，F代流式細胞儀產生于20世紀70年代,經過幾十年的發展和完善,今天的流式細胞儀已經十分成熟,并被廣泛地運用于從基礎研究到臨床實踐的各個方面,涵蓋了細胞生物學、免疫學、血液學、腫瘤學、藥理學、遺傳學及臨床檢驗等領域,在各學科中發揮著重要的作用[2-4]。

蘇州大學放射醫學與防護學院實驗教學平臺，2015年購置了一臺美國 BD 公司生產的型號為Verse的分析型流式細胞儀,主要應用于放射醫學相關科學研究,包括X射線照射對動物及細胞急性效應和遠期效應的研究工作,涉及了細胞凋亡、細胞周期、免疫細胞分型、細胞內蛋白表達、細胞表面分子、胞內游離鈣離子、核酸含量、線粒體膜電位等諸多方面?，F在,我們在放射生物學、放射毒理學、核醫學等專業的實驗教學中嘗試使用流式細胞技術,帶領學生利用流式細胞儀探索射線照射細胞引起的生物效應,極大激發了學生對專業課基本實驗的興趣。

1 流式細胞儀的原理

流式細胞儀主要由液流系統、光學系統、電子系統、數據處理系統和細胞分選系統 5 個部分組成。通過液壓系統將經熒光物質染色的單細胞懸液壓入流動室,形成極細的懸浮細胞液流與鞘液交匯、鞘液包裹逐一排列的細胞,形成中間慢、周邊快的柱狀流束,經過檢測區時,在激光器發出的激光束照射下,細胞或分散顆粒產生散射光和熒光[3]。一般在與激光束成 0°和 90°角的方向上接收散射光,包括前向角散射光( forwardscatter,FSC ) 及 側 向 角 散 射 光 ( side scatter,SSC ) 。FSC 主要反映細胞或分散顆粒的大小,SSC 主要反映細胞質、 胞膜、 核膜的折射情況以及細胞內顆粒的復雜程度[4]。 熒光信號包括自發熒光和特征熒光,自發熒光指樣本固有的熒光分子發出的熒光,特征熒光是與細胞表面或內部待測物質結合的熒光染料發出的熒光。熒光信號的強弱反映了所測細胞表面分子的數量或細胞內物質的濃度[4-6]。光信號經過一系列濾光片和反射鏡分離后,經光電倍增管接收轉化為電信號,再經模/數轉換器轉換為可被計算機識別的數字信號,再通過控制軟件對數據進行分析處理[5]。

2 儀器培訓

針對我院的本科生和研究生,學院在課余時間開設第二課堂,專門介紹一些實驗用大型儀器。在第二課堂向學生詳細介紹流式細胞儀的結構原理及應用,解析每個系統的結構及各個系統之間的相互聯系與作用,使學生對流式細胞儀有整體了解。經過第二課堂的理論培訓后,帶學生進入流式細胞儀實驗室,實地察看儀器。首先打開儀器的外殼,逐一介紹儀器內部主要備配件,包括405/488/640 nm激光器、流動室、濾光片、光纖等。然后演示開機程序,包括打開機器主開關、 開計算機和控制軟件、 添加鞘液和傾倒廢液等。儀器預熱穩定后,做開機前的清洗,包括沖洗鞘液的濾網、排氣泡、沖洗流動室。開機程序完成后,以單色和雙色實驗為例,向學生演示如何使用流式細胞儀檢測樣本及相關調節,包括建立檢測方案、 電壓調節、 熒光補償調節、樣品的采集、 結果分析、 數據的導入導出等。 最后進行儀器關機及日常維護和質檢。通過理論介紹和觀摩學習后,學生對流式細胞術的理論知識有了一定的了解。另外,在每個星期五的下午開放流式細胞儀給學生練習操作,保證每個學生都有動手操作的機會,并能夠熟練掌握儀器和軟件的操作。

3 實驗課設計

(1) 實驗題目:使用流式細胞儀檢測X射線照射對腫瘤細胞的凋亡和周期的影響。

(2) 實驗目的:掌握碘化丙啶(Propidium iodide,PI)和Annexin-V熒光探針染色法測定細胞凋亡和細胞周期,了解流式細胞儀原理和使用,初步探索X射線對腫瘤細胞的殺傷效應。

(3) 實驗原理:細胞凋亡是一種由基因控制的具有一定特征性形態和生化改變的細胞程序性死亡過程[7],輻射及其他因素均可誘導細胞凋亡[8]。細胞凋亡早期位于胞膜內側的磷酯酰絲氨(phosphatidylserine,PS)會翻轉到細胞膜外表面[9]。 Annexin-V 能與 PS 高親和特異性結合,利用這一原理可以使用Annexin V 檢測凋亡早期細胞[10]。碘化丙啶(propidine iodide,PI)為一種核酸染料,它不能透過正常及早期凋亡細胞的細胞膜,但是凋亡中晚期及死細胞的細胞膜已經嚴重破損,此時PI 可以透過細胞膜進入細胞核與核酸結合。所以Annexin-V-FITC單染的細胞是凋亡早期細胞, Annexin-V-FITC/PI 雙染色的細胞是凋亡晚期細胞,利用流式細胞儀檢測2種染料的熒光信號，即可得到細胞凋亡的數據[11]。細胞周期是利用PI和核酸結合,通過檢測PI的熒光強度來定量細胞中核酸的含量,其中G2/M期細胞中的核酸含量是G0/G1期細胞的2倍,所以通過細胞中核酸含量可以確定細胞周期中的時相[12]。

(4) 儀器和材料:流式細胞儀,X射線機,CO2培養箱,超凈工作臺,低溫離心機,移液器,人非小細胞肺癌細胞系A549,胎牛血清,PRMI1640,PBS(磷酸鹽緩沖液),0.25%胰酶,AnnexinV-FITC(磷脂結合蛋白),PI(碘化丙啶染料),RNA酶,70%乙醇。

4 實驗方法

4.1 實驗一:檢測X射線照射對A549細胞凋亡的影響

(1) 人非小細胞肺癌細胞A549培養。將凍存的A549細胞復蘇后,接種在含10%胎牛血清的PRMI1640培養液中,放置在5% CO2培養箱中37 ℃培養。待細胞貼壁生長到80%左右,在超凈工作臺里面,消化細胞,將細胞傳代接種在若干直徑為60 mm的培養皿內,1～5×105細胞每皿。

(2) 分組。將上一步已經接種有細胞的培養皿分為2組,一組不照射,另一組照射X射線。

(3) 照射。將照射組的細胞放進X射線機中照射X射線,劑量為4 Gy。

(4) 收樣。照射后2組細胞繼續培養48 h后,先離心收集培養基中的漂浮細胞,然后使用0.25%胰酶消化皿底貼壁細胞,加入離心管離心，棄上清獲得細胞。再用預冷的PBS洗滌細胞2次,每次均需1 000 r/min,4 ℃離心5 min。

(5) 染色。加入100 μL PBS重懸細胞,再加入5 μL Annexin-V-FITC和5 μL PI ,輕輕混勻。另外,需要做一個單染 Annexin-V-FITC和一個單染PI的樣本。避光、室溫反應15 min后加入400 μL PBS,混勻。

(6) 流式細胞儀檢測。在儀器控制軟件中建立檢測細胞凋亡的程序,用單染 Annexin-V-FITC和單染PI的樣本調節電壓和補償。每個樣本收集1萬個細胞,獲取數據分析結果。

4.2 實驗二:檢測X射線照射對A549細胞周期的影響

(1)—(3) 步同實驗一。

(4) 收樣。照射后兩組細胞繼續培養12 h后,使用0.25%胰酶消化皿底貼壁細胞,加入離心管1 000 r/min、4 ℃離心5 min,棄上清獲得細胞。

(5) 固定。各組細胞中加入預冷70%乙醇1 mL重懸細胞,于4 ℃固定過夜,或-20 ℃長期固定

(6) 染色。離心棄上清收集細胞,以1 mL的PBS洗細胞一次,再加入500 μL PBS與染料混合液(含50 μg/mL溴化丙錠(PI),100 μg/mL RNase A,0.2% Triton X-100)重懸細胞,4 ℃避光孵育30 min。

(7) 過濾。使用300目的濾網對染色后的細胞懸液進行過濾,濾除細胞團。

(8) 流式細胞儀檢測。在儀器控制軟件中建立檢測細胞周期的程序,收集2～3萬個細胞,獲取數據并用ModFit軟件分析。

5 實驗結果分析

凋亡受阻是腫瘤發生的主要原因,誘導腫瘤細胞分化和凋亡已成為當前腫瘤治療的熱點[13]。 本實驗課帶領學生初步探討了一定劑量 X 射線照射對肺癌 A549 細胞凋亡和周期的影響。凋亡的檢測結果如圖1所示。使用雙參數散點圖中的十字門將處于不同凋亡時期的細胞群體分開,x軸表示Annexin-V的熒光強度,y軸表示PI的熒光強度。結果顯示X射線照射組的早期凋亡細胞比例為5.39%,晚期凋亡為4.81%,與不照射組比較,凋亡細胞明顯增加。這一現象說明X射線照射細胞后,引起細胞凋亡。X射線對A549細胞周期的影響,通過ModFit軟件分析,結果如圖2所示,照射組的G0/G1期細胞比例為45.8%、S期為28.9%、G2/M期為25.3%,與不照射組比較,細胞周期發生了變化,出現G2/M期阻滯。

圖1 X射線照射后A549的細胞凋亡

圖2 X射線照射后A549的細胞周期

6 結語

將流式細胞儀應用于放射生物學的實驗教學,可以讓教學和科研、理論與實踐有效結合。利用課余時間開設第二課堂,講解與流式細胞儀相關的基礎知識,有助于學生對儀器的全面了解。每個星期安排專門的時間供學生練習操作儀器,提高了學生的動手能力。同時,開設使用流式細胞儀檢測X射線照射后腫瘤細胞的凋亡和周期的實驗課,帶領學生初步探索X射線治療腫瘤的原理,可以將臨床上腫瘤放療的實踐與課堂學習的理論知識有機結合,極大激發了學生的學習興趣,有利于提高教學質量,取得較好的教學效果。同時,每個學生都學會流式細胞儀的操作,提高了儀器使用率,讓現有的大型儀器更好地為教學和科研服務。

References)

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[2] 杜立穎,張麗君.流式細胞術新實驗的開發[J].實驗技術與管理,2004,21(6):17-20.

[3] 鄧喜林,林躍智,李蕊,等.流式細胞術在免疫學上的應用及其發展前景[J].東北農業大學學報,2009,40(6):137-140.

[4] 李志,楊明杰,周建嫦.流式細胞術在毒理學檢測中的應用[J].衛生研究,2004,33(4):504-507.

[5] 張英,黎宏宇,李莉,等.流式細胞術在實驗教學中的開發與應用[J].實驗室研究與探索,2013,32(7):206-208.

[6] 趙書濤,武曉東,王策,等.流式細胞儀的原理、應用及最新進展.[J].現代生物醫學進展,2011,22(1):4378-4381.

[7] Kurdi M,Booz G W. Jak inhibition,but not Stat1 knockdown,blocks the synergistic effect of IFN-gamma on Fasinduced apoptosis of A549 human non-small cell lung cancer cells[J].J Interferon Cytokine Res,2007,27(1):23-31.

[8] Chen Q,Xia X,Wu S,et al.Apoptosis,necrosis,and autophagy in mouse intestinal damage after 15-Gy whole body irradiations[J].Cell Biochem Funct,2014,32(8):647-56.

[9] 叢玉隆.流式細胞儀及其臨床應用[J].醫學檢驗與臨床,2006,17(4):1-2.

[10] Vermes J,Haanen C,Steffens N,et al.A novelassay for apoptosis:Flow cytometric detetion of phosphatidy lserineex pression on early apoptic cells using fluoreescine labeled Annexin V[J]. Immunol Methods,1999,184(1):39-42.

[11] 吳建勇,趙德璋.流式細胞儀檢測細胞凋亡的幾種方法的比較[J].重慶醫科大學學報,2010,35(9):1386-1389.

[12] Lee Y M,Ting C M,Cheng Y K,et al. Mechanisms of 2-methoxyestradiol-induced apoptosis and G2/M cell-cycle arrest of nasopharyngeal carcinoma cells[J].Cancer Lett,2008,268(2):295-307.

[13] 羅利民.電離輻射對肺癌A549 細胞凋亡及細胞周期的影響[J].腫瘤學雜志,2009,15(5):401-411.

Application of flow cytometry to experimental teaching of radiobiology

Wu Anqing, Nie Jing, Pei Hailong, Zhang Jian, Zhou Guangming

(School of Radiation Medicine and Protection,Soochow University,Suzhou 215123, China)

Based on the characteristics of experimental teaching in Radiation Medicine, a second class is set up to teach principles and applications of flow cytometry, and an experimental lesson is designed for students to learn how to use flow cytometry to detect the apoptosis and cell cycle of tumor cells after X-ray irradiation.Besides,making a fixed time schedule for students to practice by themselves, can improve the students’ interest in scientific research and ability in practical operation.

flow cytometry； radiobiology； experimental teaching

10.16791/j.cnki.sjg.2017.01.044

2016-07-04 修改日期：2016-09-22

江蘇省高校放射醫學協同創新中心項目(SX12800114)；中國博士后第59批面上資助項目(7131705016)

吳安慶(1987—),男,安徽樅陽,在職博士研究生,助理實驗師,研究方向為腫瘤免疫

E-mail：aqwu115@suda.edu.cn

周光明(1970—),男,湖北枝江,博士,教授,研究方向為空間輻射生物學.

E-mail：gmzhou@suda.edu.cn

G424.28

A

1002-4956(2017)1-0184-03