電擊法誘導(dǎo)細胞融合實驗研究

王宏剛， 李 燁， 陳成彬， 王春國， 陳 力， 宋文芹， 白艷玲， 張金紅， 劉 方

(南開大學 生物實驗教學中心，天津 300071)

電擊法誘導(dǎo)細胞融合實驗研究

王宏剛， 李 燁， 陳成彬， 王春國， 陳 力， 宋文芹， 白艷玲， 張金紅， 劉 方

(南開大學 生物實驗教學中心，天津 300071)

分別利用兩種不同的熒光染料Dio和DiI對細胞進行標記，使細胞膜可以發(fā)出綠色或紅色熒光;然后選擇合適的條件，使用細胞融合儀誘導(dǎo)2個細胞融合成為1個細胞;最后，通過熒光顯微鏡觀察，成功融合的細胞可以同時觀察到紅色熒光和綠色熒光。該實驗可以幫助學生掌握電擊誘導(dǎo)細胞融合的原理和操作方法，培養(yǎng)學生的科研興趣，提高學生的綜合素質(zhì)。

細胞融合; 電擊法; 實驗教學; 教學改革

細胞融合技術(shù)興起于20世紀60年代[1],是一種利用特定方法使2個細胞(原生質(zhì)體)發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合形成雙核或多核的雜合細胞的技術(shù),也稱為細胞雜交[2]。細胞融合技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥[3]、腫瘤研究[4]、環(huán)境微生物學[5]、作物育種[6]等領(lǐng)域。細胞融合的方法有生物法、化學法和物理法3類。目前,在本科實驗教學中使用最多的是化學法,通過聚乙二醇(PEG)來誘導(dǎo)細胞融合[7-9]。近些年來,有著效率高、細胞毒性低、操作簡單等優(yōu)點的電擊法越來越多地應(yīng)用在科研中。為了讓本科生能夠掌握電擊法誘導(dǎo)細胞融合的原理與實驗方法,我們對如何在本科實驗教學中開設(shè)電擊法誘導(dǎo)細胞融合實驗進行了大量的探索,取得了良好的教學效果。

1 實驗材料與試劑

實驗材料：人宮頸癌細胞HeLa細胞株、人T淋巴細胞白血病細胞Jurkat細胞株

主要試劑：DMEM培養(yǎng)基，1640細胞培養(yǎng)基，小牛血清，雙抗，胰蛋白酶，BS緩沖液，甘露醇，MgCl2，CaCl2，Dio，DiI。

2 實驗方法

2.1 細胞標記

(1) 選擇生長狀態(tài)良好的貼壁生長細胞,棄去培養(yǎng)基,加入0.25%胰蛋白酶進行消化,使用低速離心機1 000 r/min離心10 min,棄去上清液(如使用懸浮培養(yǎng)的細胞可省略此步驟)。

(2) 加入適量培養(yǎng)基,充分吹打重懸細胞,1 000 r/min離心10 min,棄去上清液。重復(fù)2～3次,充分洗凈細胞。

(3) 將收獲的細胞分為2份,加入適量培養(yǎng)基,2份細胞分別加入5 μL DiI或Dio(5 mmol/L 使用DMSO配制),放入二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)0.5～1 h。

2.2 細胞融合

(1) 將標記好的細胞以1 000 r/min離心10 min,棄去上清液,加入適量電融合緩沖液(0.3 mol/L 甘露醇,0. 1 mmol/L MgCl2,0. 05mmol /L CaCl2)重懸細胞,調(diào)整細胞密度為1×105個/mL。

(2) 分別吸取50 μL經(jīng)過Dio和DiI標記的細胞懸液,充分混合后加入電融合杯中,使用電融合儀選擇合適的脈沖類型和電壓(如:Hela細胞和Hela細胞融合采用指數(shù)衰減波,電壓為80 V/mm,Jurkat細胞和Hela細胞融合采用指數(shù)衰減波,電壓為70 V/mm,)進行細胞融合。

(3) 將融合完成的細胞懸液從電融合瓶中吸出,放入3.5 cm培養(yǎng)皿中,加入1 mL 1 640細胞培養(yǎng)基(培養(yǎng)基類型根據(jù)細胞株系類型選擇),放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5～1 h。

(4) 取少量細胞懸液,滴在潔凈的載玻片上,再加入2 μL含DAPI的防熒光淬滅劑,置熒光顯微鏡下觀察細胞融合的情況。

3 實驗結(jié)果

在細胞融合之前,一份細胞被Dio標記后發(fā)出綠色熒光,另一份細胞被DiI標記后發(fā)出紅色熒光。細胞融合后,融合成功的細胞會同時發(fā)出綠色熒光和紅色熒光,經(jīng)DAPI標記后,細胞核會發(fā)出藍色熒光(見圖1和圖2)。

圖2 Jurkat細胞和Hela細胞融合(顯示細胞融合完成)(100×)

4 討論

4.1 本科教學中采用電擊法的優(yōu)勢

(1) 與科研不同,實驗教學需要有較高的成功率,電擊法的融合效率比較高,可以保證實驗結(jié)果的陽性率,提高學生的學習興趣。

(2) 電擊誘導(dǎo)法的原理和實驗步驟都較為簡單,便于本科生學習和操作。同時,通過對電擊法的學習可以引導(dǎo)學生舉一反三地掌握其他融合方法的實驗原理。

(3) 實驗的安全性是本科實驗教學中必須要考慮的因素,跟其他方法相比,電擊法使用的試劑種類較少,且均為實驗室常用普通試劑,不存在生物安全、環(huán)境污染等方面的安全隱患。

4.2 實驗教學過程中的注意事項

(1) 實驗使用的細胞狀態(tài)要好。在本實驗中,細胞的狀態(tài)對細胞融合的效率影響很大。如果學時充裕,可先對學生進行細胞培養(yǎng)相關(guān)技能的訓練后再開展細胞融合的實驗,如果學時有限,可以由教師代為準備實驗材料。

(2) 電擊的條件要根據(jù)不同的細胞類型來進行調(diào)整。脈沖類型、電擊強度等參數(shù)都會對細胞的融合效率造成影響[10-11]。電擊過于溫和、融合效果不好,電擊過于強烈則會造成細胞大量死亡。教學過程中,考慮到本科生并沒有足夠的實驗經(jīng)驗,需要教師提供一個合適的電擊條件,或者對電擊參數(shù)給一個參考范圍,由學生自己設(shè)計實驗進行優(yōu)化。

5 結(jié)語

隨著新技術(shù)、新方法的不斷涌現(xiàn)及在細胞生物學研究領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用,對細胞生物學實驗教學進行改革勢在必行[12]。本實驗在教學思路和實驗內(nèi)容上進行了大膽的改革,在夯實學生基本實驗技能的基礎(chǔ)上開闊和拓展了其科學研究的視野和方法,幫助學生學習細胞生物學領(lǐng)域的先進技術(shù),為其后續(xù)的科研訓練課程打下了良好的基礎(chǔ)?；谏锘A(chǔ)實驗教學在創(chuàng)新教育中的重要作用,我們對教學方法、教學內(nèi)容等進行了積極的創(chuàng)新,將經(jīng)典實驗方法與現(xiàn)代實驗技術(shù)相結(jié)合,以期通過改革更好地培養(yǎng)學生的創(chuàng)新思維、創(chuàng)新精神和創(chuàng)新能力[13]。南開大學國家級實驗教學示范中心的“細胞生物學實驗”為南開大學校級精品課程,本實驗是一次對精品實驗課程建設(shè)改革的嘗試,對促進實驗教學示范中心的建設(shè)也起到了良好的示范作用[14]。

References)

[1] 趙志強,鄭小林,張思杰,等.細胞融合技術(shù)[J].生物學通報,2005,40(10):40-41.

[2] 李樂,張城碩,張佳林. 細胞融合技術(shù)及其應(yīng)用研究進展[J]. 遼寧醫(yī)學雜志,2013,27(4):195-198.

[3] 孫沛懋.淺析細胞融合技術(shù)在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用[J].科技創(chuàng)新與應(yīng)用,2013(28):28.

[4] 米蕊芳,潘春曉,卞曉翠,等.細胞融合通過PI3K-AKT通路降低黑色素瘤細胞增殖能力[J].基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床,2012,32(6):682-686.

[5] 任柏林,謝水波,唐振平,等.細胞融合技術(shù)及其在構(gòu)建水處理工程菌中的應(yīng)用[J].安全與環(huán)境學報,2010,10(3):20-24.

[6] 陳潔,劉田田,徐雪平.草莓品種資源和遺傳育種研究進展[J].福建農(nóng)業(yè),2014(9):31-33.

[7] 章靜波,黃東陽,方瑾.細胞生物學實驗技術(shù)[M].北京:化學工業(yè)出版社,2011.

[8] 王金發(fā),何炎明,劉兵.細胞生物學實驗教程[M].2版.北京:科學出版社,2011.

[9] 王晶珊,王愛華.細胞工程實驗教程[M].北京:高等教育出版社,2011.

[10] 張斌,華再東,鄭新民,等.豬去核無透明帶卵母細胞電融合參數(shù)的探討[J]. 中國畜牧獸醫(yī),2014,41(4):206-210.

[11] 黃淺,賴鐘雄,賴呈純,等. 荔枝TPEC 與龍眼EC 的電融合參數(shù)研究[J]. 福建農(nóng)林大學學報(自然科學版),2014,43(4):361-368.

[12] 王宏剛,陳成彬,王春國,等.綜合院?！凹毎飳W實驗”教學改革探索[J].實驗技術(shù)與管理,2014,31(1):191-193.

[13] 解麗芳,林宏輝.生物基礎(chǔ)實驗教學中心的創(chuàng)新教育作用[J].實驗技術(shù)與管理,2016,33(5):168-169,177.

[14] 王金發(fā),王宏斌,劉兵,等.創(chuàng)新“細胞生物學與遺傳學實驗”精品課程建設(shè) 提升生物學實驗教學示范中心的示范作用[J].實驗技術(shù)與管理,2013,30(6):1-5.

Research on experiment of cell fusion induced by electric shock

Wang Honggang, Li Ye, Chen Chengbin, Wang Chunguo, Chen Li, Song Wenqin, Bai Yanling, Zhang Jinhong, Liu Fang

(Biological ExperimentalTeaching Center, Nankai University, Tianjin 300071, China)

By using two different fluorescent dyes of Dio and DiI to mark the cells respectively, the cell membrane can send out green or red fluorescence. Then, by choosing certain proper conditions, the cell fusion apparatus is used to induce the fusion of two cells into one. Finally, with the fluorescence microscope, the red fluorescence and the green fluorescence can be observed at the same time in the fused cells. Through this experiment, it can help the students to master the principles and operation method of the cell fusion induced by electric shock, cultivate the students’ interest in scientific research, and improve their comprehensive quality.

cell fusion; electric shock method; experimental teaching; teaching reform

10.16791/j.cnki.sjg.2017.01.013

2016-07-29

國家基礎(chǔ)學科人才培養(yǎng)基金“條件建設(shè)項目”(J1310003)；教育部2016年度基礎(chǔ)學科拔尖學生培養(yǎng)試驗計劃研究課題(201612)；南開大學2014年本科一般教學改革項目

王宏剛(1982—),男,山西繁峙,碩士,實驗師,從事細胞生物學實驗和遺傳學實驗教學

E-mail：whg820604@nankai.edu.cn

陳成彬(1972—)男,河北冀州,博士,副教授,研究方向為分子細胞遺傳學.

E-mail：chencb@nankai.edu.cn,

Q813.2

A

1002-4956(2017)1-0053-03