現代藥物分析最新進程

高松紅

長春醫學高等?？茖W校，吉林長春 130031

現代藥物分析包括鑒別、檢查、含量檢測和對藥物質量進行靜態控制，研究范圍涵蓋藥物研制和使用的所有流程，藥物分析在藥物的研究、開發、制備、生產中起著不可或缺的作用，現代藥物分析常用的技術主要涉及光譜、色譜和質譜及其聯用技術。藥物分析要求運用不同的檢測手段，完成對藥物分子定量定性的研究。

1 光譜、波譜相關技術

1.1 光譜相關

紫外線光譜、熒光光譜和化學發光都屬于光譜相關的藥物檢測技術，其中最常用的是紅外光譜和拉曼光譜，他們廣泛應用于藥物的含量測定、水分測定、結晶行為、組成均勻度和固態的物理化學性質相關的表征。近紅外光譜波長在0.75~2.5 nm間，具有快速、無損、強度弱、吸收峰相互重疊的特點，可用于多種組分的同時檢測，高光譜分離的近紅外有幾十微米的分辨率，是識別假藥成分的有效方法，近紅外光譜是利用分子中C—H,O—H,N—H鍵的倍頻及合頻振動所產生的吸收光譜分析、鑒別藥物成分。紅外光譜得到的結果要聯合聯合化學計量學途徑進行分析，通過偏最小二乘法、主成分分析法、人工神經網絡法等犯法建立數學模型，進而對藥物成分進行準確的分析。遠紅外光譜波長在25~1 000 nm，不僅可以用于檢測多晶型的純度，還能用于確定蛋白質的構象、考察藥物組分的均勻度等，在定量分析方面具有強容錯性、高可信度的特點。拉曼光譜是散射光譜，它通過分子的振動與轉動研究分子的機構，具有穿透力強、樣品容量少、信息獲取途徑多、硬件易攜帶的特點主要用于鑒別實驗和結構解析，最新的用于藥物分析的拉曼光譜有共振拉曼光譜、表面增強拉曼光譜和傅立葉變換表面增強拉曼光譜等，共振拉曼光譜是通過信號增強效應達到藥物分析的目的，空間位移拉曼光譜可以直接通過外包裝對藥物進行鑒別，NIR光譜儀是當前拉曼光譜技術的主要儀器，它用于分析藥物配方中的活性成分，與拉曼光譜技術聯合能高效鑒定藥物的真假。另外，還有熒光光譜和化學發光等技術，它們的優勢在于高靈敏度和高特異性，可以應用于多種藥物成分的同時定性定量的分析。

1.2 色譜相關

色譜方法具有普遍具有快速、穩定、高效的優點，它利用藥物中各成分在某一物質中的吸附或溶解性能的不同，或和其他親和作用性能的差異，使混合物流經該種物質，其原理與化學實驗中的萃取有些相似。色譜法對樣品預處理的要求不高，目前廣泛應用于藥品分析中。色譜分析可以大致分為薄層色譜法、液相色譜、氣相色譜、固相色譜等。薄層色譜是將被分離的溶液點在專用薄層板的一段，用溶劑將試樣分開，薄層色譜系統耐用性良好、靈敏度高，檢測樣品速度快，是快速分離和定量分析藥品的重要技術，薄層色譜法可以檢測中保健品中的非法的雙胍類成分，與拉曼光譜聯用可以檢測中草藥中的結構類似物、血液中的嗎啡等。液相色譜法應用范圍極為廣泛，它以液體溶劑作為流動相，實現藥物的快速分離，普遍應用于原料藥生產和制備過程。高速逆流色譜是液相色譜中最先進最常用的技術，它的優點是不需要固相載體、操作快捷、樣品回收率高，它可以用于小量分析和規模純化，HSCCC廣泛應用于天然植物活性成分藥物的分離，在可以應用于有機酸、生物堿、香豆素、植物多酚等幾乎所有的天然植物化學成分的分離，所以天然產物的粗提物的提純一般都用HSCCC，經實踐，使用高速逆流色譜對藥物進行提純純度可以達到90%以上。氣相色譜具有高效快速的分離特性，適用于揮發性組分分析和殘留溶劑的檢測，應用最廣泛的是反相模式。近些年來，氣相色譜研發出了親水作用色譜、疏水作用色譜等。目前色譜的研究集中于使用整體柱或小孔徑填料色譜柱以減低樣品分析時間，達到快速高效的目的，在超高壓液相色譜中可根據耐受氣壓選擇色譜柱，最高可選擇1.5 nm及3 nm孔徑的色譜柱，研究難度在于超高壓力條件下液體可壓縮性會引起液體的非線性升溫，溫度的變化難以控制給方法開發增加了難度。

1.3 質譜相關

近些年來，適用于大氣壓下直接離子化的質譜表面分析技術（又稱MS）方興未艾，目前質譜相關的藥物分析技術主要有噴霧解吸電離和實時直接分析2種，利用這些技術可以省略樣品處理步驟，方法的適用性較強。MS可以進行現場實時的快速分析，幾秒鐘內便可獲得結果。使用大氣壓下超聲噴霧分析藥物組分，只需要氮氣或空氣做輔助，操作和條件都很簡單,而且使用面解吸大氣壓化學電離結合PCA法能成功測出復雜藥品的物質組成、活性成分、質譜指紋譜信息和制備工藝等，無需對藥品進行提前處理就可以準確的追蹤到其來源，這種方法在檢驗藥物的真偽方面有廣泛的應用。色譜-質譜聯用技術將色譜的分離能力與質譜的高選擇性結合在一起，與傳統檢測器相比，它可以得到藥品的更多信息，主要應用在代謝產物、天然藥物和殘留物的成分分析。在藥物分析中，質譜起到了色譜的選擇器的作用，極大的提高了色譜的鑒定能力，在生物藥品的測定中有很大的優勢，最近，Zhu等采用液相色譜-串聯質譜聯用的方法成功測出人體血液中的各種成分，定量分析了血液中的米力農，而色譜所用的時間僅有3 min，同樣是應用UPLC-MS/MS方法，Micˇová等將其與 FIA2方法結合測定了白血病患者血液中的伊馬替尼，不精確度低于5.7%,回收率大于93%，顯示出高一致性。在藥物代謝研究中，使用LC-MS法可以避免繁雜的分離樣品的步驟，能節省大量的時間和精力，藥物代謝研究中常用的方法是多反應監測和碰撞誘導解離，多反應監測可以有效提高檢測的靈敏度，碰撞誘導解離能打碎樣品的分子離子，進而通過各種方法對其進行掃描，可以得出代謝產物的結構，研究表明，通過UPLC-MS/MS法，可以高效快速的分離中藥單體及其代謝產物，結合負離子ESI-MS圖譜可以分析出代謝產物的結構式。在殘留藥物成分鑒定分析方面，液相色譜-串聯質譜聯用法將人們對殘留藥物定量分析的下限一再提高，可以準確的分析出ng級和pg級的殘留藥物的成分和結構，Xia等利用UPLC-MS/MS法成功測定出牛奶中的苯并咪唑類殘留物，整個分離過程僅用了 8 min，且定量范圍在 0.01～0.5 μg/mL 之間，展現出極高的靈敏度。

2 其他方法

2.1 時間分辨熒光分析法

時間分辨熒光分析法是以具有獨特熒光特性的鑭系元素及其螯合劑作為示蹤物，建立的一種新型的非放射性微量分析技術。它是近些年研發的最靈敏的微量分析技術，通過適當的激發光源和檢測體系，利用鑭系元素及其螯合物的發光特性分辨各種藥物成分。時光分辨熒光分析法的基礎是FIA，與EIA法、CLIA法不同的是，螯合物的熒光波長與激發波長的差異使雜色光很容易被分辨出來，光電接收器與激發光的分離使分析結果的精確度大大提高，在需要超微量分析的時候，時間分辨熒光分析法最大程度上減小了激發光的雜色光對實驗結果的影響，與普通光學分析方法相比靈敏度有明顯的提高。時光分辨熒光分析法的靈敏度在10~18 mol/well(Eu3+)之間，線性度為（10~18）~（10~12）mol/well(Eu3+)，其標記離子的熒光激發光波長范圍寬于一般光學分析方法，發射光譜峰范圍則較窄，可以有效的增加熒光強度，提高各類熒光的分辨率，進而提高藥物成分的分析效率和精確度?；谄淇蛇M行多標記、特異性高、穩定性好、重復性好的特點，時間分辨熒光免疫分析可以應用于甲狀腺激素、甾體類激素、病毒性肝炎標志物、腫瘤相關抗原、多肽類藥物等的分析。

2.2 生化藥物分析中應用的技術

生化藥物大致可以分為多肽類、酶類和單克隆抗體3種。目前已有多種對多肽類藥物進行檢測分析的方法Wang等通過金屬螯合物親和色譜和陽離子交換色譜純化，經MALDI-TOFTOF-MS確定藥物分子量，并結合基因組學等昂法確定了多肽類藥物中的氨基酸殘基類型；劉永福等構建了Tricine-SDS-PAGE和LC-MS多反應監測（MRM）方法，用于定量測定多肽和蛋白質；李萍等通過質譜檢測和溴化氰裂解蛋白質C末端方法檢測出了多肽類藥物的全部C末端。對于酶類藥物，最近毛歆等建立了測定注射用降纖酶中降纖酶的高效液相色譜分析方法；Liu等建立了凝膠電泳和輔助激光解析飛行時間質譜法，測定酶類藥物純度達到98%。單克隆抗體藥物分析較多肽類藥物更為復雜，因此其分析研究系統需要更完善，最近畢華等通過HUVEC增殖抑制試驗、SDS-PAGE、SEC-HPLC、胰酶酶切和 HPLC、定量 PCR、ELISA、水平等電聚焦電泳等方法建立了VEGF單抗的質控方法和質量標準。

2.3 中藥分析技術

中藥多組分同時分離分析技術是有多種多種方法和技術的整合為以多組分為研究對象的中藥分析技術，HILICTOF-MS與RPLC-TOF-MS相結合、HPLC-TOF-MS法、(HPLC-LTQ-Orbitrap-MS、HPLC-MS、GC-MS、 柱切換技術等都是目前中藥組分分離分析常用的方法；中藥指紋圖譜技術是通過聯用技術對中藥組分詳細準確的組分含量和鑒別分析的技術，目前最新的技術有HPLC-DAD法、LCDAD-MS/MS法、UPLC-光電二極管陣列檢測器（PDA）技術等；中藥體內過程研究大多采用色譜及其聯用技術，因為它具有靈敏、準確的優點，HPLC、UPLC-MS、HPLCMS、GC-MS、HPLC-Q-Trap、UPLC-Q/TOF-MS 以及HPLC-TOF和HPLC-Q-IT結合的方法都是中藥體內研究的常用的方法；中藥品質控制和鑒別是實現中藥現代化的重要環節，因此，中藥品質控制和鑒別的研究一直是中藥分析的重要部分，HPLC、GC、HPCE及相應的聯用技術、DART-MS技術、NIR光譜法等在中藥品質控制與鑒別中都有重要的地位。

3 結語

藥物分析水平的不斷提高推進了藥物研發、制備的進程，隨著藥物分析方法的不斷進步，新技術和新設備逐漸被用于藥物分析，更先進的藥物分析技術水平和更微型化、集成化、智能化的儀器設備的應用使藥物分析越來越快速、準確，藥物分析的發展為創新藥物的研究、開發和研究使藥物的安全性、有效性有了更高的保障，并進一步促進了藥物科學的進步。

[1]張禎，劉景富，姚焱，等.競爭雙標記時間分辨熒光免疫分析法同時測定豬肉組織中氯霉素和萊克多巴胺研究[J].科學通報，2011，56（4-5）：304-308.

[2]吉飛躍，錢開成，崔益祥.時間分辨熒光分析法檢測低值乙型肝炎病毒表面抗原的質量評價[J].分子診斷與治療雜志，2012，4（5）：329-332