水生動物嗜水氣單胞菌新型疫苗研究進展

尹玉偉 ， 張培軍 ， 夏克立 ， 康學會 ， 劉新宇 ， 李月紅

(1.吉林農業大學動物科學技術學院， 吉林長春130118； 2.吉林省衛生監測檢測中心， 吉林長春130118；3.吉林省水產科學研究院， 吉林長春130000； 4.吉林省長春市新立城水庫管理局， 吉林長春130119)

水生動物嗜水氣單胞菌新型疫苗研究進展

尹玉偉1， 張培軍2， 夏克立3， 康學會3， 劉新宇4， 李月紅1

(1.吉林農業大學動物科學技術學院， 吉林長春130118； 2.吉林省衛生監測檢測中心， 吉林長春130118；3.吉林省水產科學研究院， 吉林長春130000； 4.吉林省長春市新立城水庫管理局， 吉林長春130119)

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila，Ah)屬于弧菌科、氣單胞菌屬，自然界中廣泛分布，可引起魚類、兩棲類及爬行類動物暴發出血性敗血癥，并且對人類也有致病性，是一種典型的人-獸-魚共患的致病菌。Ah是魚類發病的主要病原，對水產養殖造成巨大的經濟損失，過去對Ah的防治主要以抗生素為主，隨著國內外的學者對Ah的研究逐漸深入，防治Ah的疫苗也有了很大的進展。本文將從嗜水氣單胞菌的核酸疫苗、重組亞單位疫苗以及菌蛻疫苗的研究進行綜述。

1 核酸疫苗

核酸疫苗近些年發展起來的新技術，是用編碼免疫原或者與免疫原相關的真核生物表達質粒DNA(或RNA)，它經過一定的途徑進入動物體內后，被動物宿主細胞攝取后能轉錄和翻譯表達出抗原蛋白，此抗原蛋白能夠刺激機體產生免疫應答，從而起到免疫保護的作用[1]。

雖然魚類核酸疫苗研究起步較晚，但是近些年也取得的很多成果。自1991年，Hansen等通過給鯉魚注射重組的DNA后，能在肌肉中檢測出相應的表達產物[2]。2013年，中國學者李盼等通過現有文獻對Ah外膜蛋白momp進行PCR擴增后，轉入真核表達載體，獲得重組質粒，構建DNA疫苗；將表達蛋白免疫SD大鼠，重組質粒轉染293細胞，用ELISA對大鼠血清進行檢測，RT-PCR對轉染細胞進行檢測，都證明momp的表達，為下一步動物試驗打下了基礎[3]。與此同時，在2013年，美國學者Pridgeon通過重組一種載脂蛋白(ApoA1)，將ApoA1基因的DNA重組到質粒中，通過注射斑點叉尾鮰后，發現ApoA1能在魚體組織中表達，在對嗜水氣單胞菌具有較好的免疫保護作用，提出ApoA1能作為嗜水氣單胞菌的DNA疫苗[4]。

2 重組亞單位疫苗

亞單位疫苗是通過提取病原微生物的某些成分制成的疫苗，如病毒的衣殼蛋白、包膜蛋白，細菌的外膜蛋白、脂多糖(LPS)、類毒素、外毒素等。

近些年Ah重組亞單位疫苗取得了不小的進展，2010年，張翠娟等在對Ah的溶血素基因(hly基因)進行PCR擴增后，轉入原核表達載體，轉染大腸桿菌，發現獲得產物能與抗體相互結合，將表達的產物做成類毒素免疫小鼠后發現具較高的保護效率[5]。之后，在2012年，Wu等通過克隆、純化嗜水氣單胞菌的膜外蛋白epr2～3，免疫ICR小鼠后得到較高的抗體滴度，在免疫沒有接觸過嗜水氣單胞菌的鳊魚后得到較好的免疫保護，并且與普通滅活苗對比免疫效果得到了顯著的提升[6]。Maiti等通過克隆Ah的兩個表面蛋白Aha1和OmpW，分別注射免疫鯉魚后，在用Ah感染后，存活率分別提高到52%和71%[7]。Wang等通過重組提取Ah的表面膜蛋白Omp38，分離純化后的蛋白、死疫苗和PBS同時進行免疫鯉魚，發現IgM滴度和注射死疫苗的組沒有顯著差異，并且都顯著高于PBS組；除此之外，SOD、溶酶體活性和頭腎細胞的吞噬作用顯著高于其他組；在應對Ah感染時，Omp38蛋白表現出較好的效果[8]。在2015年，Liu等用低聚糖核苷酸為引物，將Ah的基因組導入質粒，在大腸桿菌中表達后，通過提純蛋白并用碳納米管作為載體，浸浴免疫草魚后，發現腸道微生物發生了相應的改變，七種免疫相關基因(IFN-I、TNF-α、CRP、IL-8、IgM、MHC I 和CD8α)在腸道，腎和脾表達顯著提高，免疫后的草魚能較好的抵抗Ah[9]。最近，2016年，Abdelhamed等在對Ah的基因進行序列分析后，篩選出四個菌毛蛋白(FimA、Fim、MrfG和FimOM)，進行蛋白質分離純化，分別通過注射免疫斑點叉尾鮰后，在對注射Ah強毒，與對照組相比存活率分別提升59.83%、95.41%、85.72%和75.01%；此外，免疫的魚肝臟、脾臟和頭腎細菌量顯著低于未免疫的魚，因此，Fim和FimMrfG蛋白適合作為Ah的候選蛋白疫苗[10]。2016年，Fu等通過將傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)的orf086蛋白基因插入到嗜水氣單胞菌的ompA的基因中，獲得重組質粒，并轉染到大腸桿菌中，再將大腸桿菌和嗜水氣單胞菌進行融合，用LB培養基進行篩選后，獲得重組的嗜水氣單胞菌，用甲醛將重組的嗜水氣單胞菌滅活后通過注射免疫鱸魚，發現這種菌能較好的保護ISKNV和Ah感染，并能提高干擾素調節因子7、白介素受體相關激酶、溶菌酶和IgM等免疫相關基因表達[11]。亞單位疫苗因其不含病原微生物的核酸，安全性較好，與此同時去除了一些不能產生保護性免疫的抗原，避免抗原之間的相互競爭，減少超敏反應的發生，提高了免疫效果，因而備受青睞。

3 菌蛻疫苗

細菌菌蛻不含細胞質和核酸成分，具有全部細菌表面抗原，并能作為自身佐劑的一種新型疫苗，由于其細胞膜上的抗原決定簇與活菌幾乎相同，所以菌蛻疫苗能激起機體廣泛地免疫反應，如黏膜免疫和細胞免疫，而菌蛻作為自身佐劑的主要成分是因為其細胞膜上含有免疫細胞能識別的特異性受體，這些具有受體能被巨噬細胞和樹突狀細胞識別，增加非特異性免疫的強度。

目前對于Ah菌蛻疫苗的研究主要是在國內，在2008年，儲衛華等利用含有裂解基因E的質粒轉化到Ah中，通過溫度誘導28 ℃升逐漸至42 ℃，并且每隔15 min檢測1次其溶菌動力學，并做無菌檢驗，掃描電鏡觀察大部分菌體誘導成菌蛻，16 h后經過試驗和檢測后，證實沒有活菌的存在。用獲得的菌蛻進行免疫銀鯽，在第5～7周產生效價達27凝集抗體，而甲醛滅活組僅在第5周產生效價為26的凝集抗體，菌蛻組和甲醛滅活組均能對Ah的強毒產生保護作用，保護效率分別是78.95%和57.9%，這些結果都顯示，菌蛻疫苗具有較好的保護作用[12]。而同一研究小組的Tu用含有嗜水氣單胞菌菌蛻(AHG)、甲醛滅活苗(FKC)和磷酸鹽緩沖液(PBS)的飼料對異育銀鯽進行免疫后，發現AHG組的血清和腸黏液中的抗體顯著高于其他兩個組，而且用Ah強毒暴露后，AHG組的存活率顯著高于其他兩個組，顯示較高的保護率[13]。在2016年，李紹戊等通過使用不同濃度的重組噬菌體E基因質粒來進行構建菌蛻疫苗，發現不同濃度的E基因質粒均能高效的誘導Ah的裂解，獲得的Ah菌蛻疫苗進行免疫鯉魚后發現能顯著提高血清抗體水平，并且保護效率高于滅活疫苗[14]。

4 展望

Ah新型疫苗的研究，在近些年取得了很多成果，特別免疫保護方面都有了很大的提升。隨著禁用抗生素的呼聲越來越強烈，疫苗防病將在養殖中扮演越來越重要的角色。Ah作為一種致病菌，除抗生素外最好的防治方法就是疫苗免疫。Ah膜表面有較多的抗原位點，因而具有較大的制備高保護疫苗的潛力，并且隨著CRISPR基因編輯技術在細菌疫苗中的應用[15]以及最近北京大學對疫苗研究的新思路[16]，制備出更高保護率的疫苗來防控Ah將很快實現。

[1] 韓一凡，鄢慶枇，高天翔，等．魚類DNA疫苗研究進展[J]．海洋科學，2005，29(3)：64-69．

[2] E Hansen，K Fernandes，G Goldspink，etal．Strong Expression of foreign gene following direct injection into fish muscle[J]．FEBS Letters，1991，290(1-2)：73-76．

[3] 李盼，李素一，吳唯維，等．嗜水氣單胞菌外膜蛋白基因DNA疫苗載體的構建及分析[J]．福建農業學報，2013，28(9)：844-848．[4] Julia W Pridgeon，Phillip H Klesius．Apolipoprotein A1 in channel catfish：Transcriptional analysis，antimicrobial activity， and efficacy as plasmid DNA immunostimulant against Aeromonas hydrophila infection[J]． Fish & Shellfish Immunology，2013，35：1 129-1 137．

[5] 張翠娟，于宙亮，田莉瑛，等．嗜水氣單胞菌溶血素基因的克隆表達及其類毒素的免疫原性分析[J]．生物工程學報，2009，25(2)：251-256．

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[7] Biswajit Maiti，Mahesh Shetty，Malathi Shekar，etal．Evaluation of two outer membrane proteins, Aha1 andOmpW of Aeromonas hydrophila as vaccine candidate for common carp[J]．Veterinary Immunology and Immunopathology，2012，149 ：298-301．

[8] Na Wang，Zhao Yang，Mingfa Zang，etal．Identification ofOmp38 by immunoproteomic analysis and evaluation as a potential vaccine antigen against Aeromonas hydrophila in Chinese breams[J]．Fish & Shellfish Immunology，2012， 34：74-81．

[9] Xiaozhe Fu，Qiang Lin，Lihui Liu，etal．Display of ISKNV orf086 protein on the surface of Aeromonas hydrophila and its immunogenicity in Chinese perch (Siniperca chuatsi)[J]．Fish & Shellfish Immunology，2016，56：286-293．

[10] Hossam Abdelhameda，Seong Won Nhoa，Gokul Turagab，etal．Protective efficacy of four recombinant fimbrial proteins of virulent Aeromonas hydrophila strain ML09-119 in channel catfish[J]．Veterinary Microbiology，2016，197：8-14．

[11] Lei Liu，Yu-Xin Gong，Bin Zhu，etal．Effect of a new recombinant Aeromonas hydrophila vaccine on the grass carp intestinal microbiota and correlations with immunological responses[J]．Fish & Shellfish Immunology，2015，45：175-183．

[12] 儲衛華，莊禧懿，路承平．嗜水氣單胞菌菌蛻的制備及其對銀鯽的口服免疫[J].微生物學報，2008，48(2)：202-206．

[13] Tu F P，Chu W H，Zhuang X Y，etal．Effect of oral immunization with Aeromonas hydrophila ghost on protection against experimental fish infection[J]．Letters in Applied Microbiology，2010，50(1)：13-17．

[14] 李紹戊，王荻，劉紅柏，等．嗜水氣單胞菌菌蛻系統的構建及其免疫效果研究[J]．西北農林科技大學學報(自然科學版)，2016，44(4)：17-23．

[15] 余深翼，趙金榮，鄭玲紅，等．利用CRISPR/Cas 9技術構建大腸桿菌aroA基因的敲除系統及其初步應用[J]．畜牧獸醫學報，2016，47(4)：762-770．

[16] Longlong Si，Huan Xu，Xueying Zhou，etal．Generation of influenza A viruses as live but replication-incompetent virus vaccines[J]．Science，2016，354：1 170-1 173.

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《中國獸醫雜志》編輯部

2016-12-29

國家自然科學基金(30972191)；農業部948項目(2014Z34)；吉林省留學人員創新創業項目(201523)

尹玉偉(1992-)，男，碩士生，從事動物疾病及免疫研究，E-mail：yuweiyin92@yeah.net

李月紅，E-mail：liyhong@sina.com

S943

A

0529-6005(2017)07-0078-03