絕經后體脂異常分布對雌性SD大鼠內臟脂肪組織脂肪因子及TNF-α表達的影響

翟玉娥，田清武，趙希芹，趙鵬，孫樹凱，岳康，翟木緒

(1青島大學附屬醫院，山東青島266555；2淄博市婦幼保健院)

·基礎研究·

絕經后體脂異常分布對雌性SD大鼠內臟脂肪組織脂肪因子及TNF-α表達的影響

翟玉娥1，田清武1，趙希芹1，趙鵬1，孫樹凱1，岳康1，翟木緒2

(1青島大學附屬醫院，山東青島266555；2淄博市婦幼保健院)

目的 探討絕經后體脂異常分布對雌性SD大鼠內臟脂肪組織脂肪因子(包括瘦素、脂聯素、抵抗素)及TNF-α表達的影響。方法 選擇6周齡雌性SD大鼠30只，隨機分為假手術組、去卵巢組和去卵巢高脂組(OVXH組)各10只，去卵巢組、OVXH組切除雙側卵巢制備去卵巢去勢(絕經)模型，假手術組僅摘除腹腔內與卵巢體積相當的脂肪組織。術后1周，假手術組和去卵巢組給予普通飼料喂養，OVXH組給予高脂飼料喂養。連續干預12周后，麻醉大鼠迅速剝離內臟脂肪組織，分別采用免疫組化染色法和RT-PCR法檢測各組脂肪組織瘦素、脂聯素、抵抗素、TNF-α蛋白及mRNA表達的變化。結果 與假手術組相比，去卵巢組和OVXH組內臟脂肪組織瘦素蛋白表達降低，脂聯素、抵抗素、TNF-α蛋白及mRNA表達均增強(P<0.05或0.01)。與去卵巢組相比，OVXH組內臟脂肪組織抵抗素、TNF-α蛋白及mRNA表達均增強(P均<0.05)。結論 去卵巢后體脂分布異常大鼠內臟脂肪組織脂聯素、抵抗素和TNF-α的表達顯著增強，瘦素表達顯著減弱，可能與絕經后代謝綜合征的發病有關。

絕經；代謝綜合征；脂肪組織；脂肪因子；胰島素抵抗；腫瘤壞死因子α

絕經后女性存在脂肪組織再分布的現象，主要表現為體脂趨于上半身型分布。這種體脂再分布可導致絕經后女性代謝綜合征和肥胖癥的發病率增高，其發生風險甚至高于同齡男性[1,2]，嚴重影響絕經后女性的身心健康。研究證實，絕經后女性雌激素的缺乏與其內臟脂肪堆積密切相關[3,4]，但其具體機制尚未完全闡明。2015年3～11月，我們對雌性SD大鼠去卵巢模擬絕經后模型，然后給予高脂飲食模擬絕經后體脂分布異常狀態，觀察大鼠內臟脂肪組織脂肪因子(包括脂聯素、瘦素、抵抗素)及TNF-α的表達變化，探討絕經后體脂異常分布狀態對絕經后女性代謝綜合征的影響機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 6周齡SD雌性大鼠30只，體質量(200±20)g，由青島藥品研究所實驗動物中心提供。分籠飼養，在室溫23～25 ℃、相對濕度50%～70%的清潔環境中飼養。高脂飼料配方為普通飼料68%、豬油10%、蛋黃粉10%、蔗糖10%、膽固醇2%[5]。TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)；PCR引物(上海生工生物工程技術公司)；Fast Quant cDNA第一鏈合成試劑盒、Super Real熒光定量PCR(SYBR Green)試劑盒(北京天根生物技術公司)；兔抗鼠瘦素單克隆抗體、兔抗鼠脂聯素抗體、兔抗鼠TNF-α單克隆抗體(英國Abcam公司)；兔抗鼠抵抗素單克隆抗體(英國Biorbyt公司)；山羊抗兔二抗PV-6001、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司)；葡萄糖(FBS)、TC、TG、LDL-C、HDL-C(北京利德曼公司)；游離脂肪酸(NEFA，浙江東甌生物工程公司)。

1.2 模型構建、分組及干預方法 SD大鼠適應性飼養1周后，采用隨機數字表法分為假手術組10例、手術組20例。手術前大鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉。手術組在無菌條件下經腰背部雙側切口進入腹腔，切除雙側卵巢后分層縫合切口，構建去卵巢去勢(絕經)模型。假手術組打開腹腔后，摘除腹腔內與卵巢體積相當的脂肪組織，縫合切口。術后1周美藍染色觀察陰道上皮細胞，如無動情周期變化則確定去勢成功，術后1周開始干預。手術組大鼠隨機分為去卵巢組、去卵巢+高脂飲食組(OVXH組)各10只。假手術組、去卵巢組給予基礎飼料喂養，OVXH組給予高脂飼料喂養模擬絕經后體脂異常分布狀態，連續12周，每周稱體質量1次，自由進食和飲水。12周后OVXH組體質量、內臟脂肪指數均明顯高于去卵巢組，血清LDL-C和NEFA水平均明顯高于假手術組，確定存在絕經后體脂異常分布狀態。

1.3 樣品采集 12周后，采用腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉各組大鼠，固定于手術臺，迅速剝離內臟脂肪組織，速凍于液氮中，隔日移入-80 ℃冰箱中保存待測。

1.4 內臟脂肪組織瘦素、脂聯素、抵抗素、TNF-α蛋白表達檢測 采用免疫組化法。取各組內臟脂肪組織，4%多聚甲醛固定，經乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋制成蠟塊。常規石蠟切片，梯度脫蠟至水，抗原熱修復，3%過氧化氫10 min滅活內源性酶。山羊血清工作液封閉，分別加稀釋好的一抗瘦素(1∶300)、脂聯素(1∶300)、抵抗素(1∶200)、TNF-α(1∶300)37 ℃孵育1 h。PBS清洗后加二抗PV-6001，37 ℃30 min，PBS清洗后加DAB顯色1 min，清洗，蘇木素復染、脫水、透明、封片，顯微鏡觀察，拍照，灰度分析采用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件。

1.5 內臟脂肪組織瘦素、脂聯素、抵抗素、TNF-α mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。提取內臟脂肪組織總RNA，紫外分光光度計檢測確定總RNA濃度及純度。嚴格按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明，合成cDNA第一鏈。瘦素引物序列：正義鏈5′-AGCAGCTGCAAGGTCCAAG-3′，反義鏈5′-CCGACTGCGTGTGTGAAATG-3′，產物長度197 bp。脂聯素引物序列：正義鏈5′-ACAAGGCCGTTCTCTTCACC-3′，反義鏈5′-ACACTTGGAGCCAGACTTGG-3′，產物長度111 bp。抵抗素引物序列：正義鏈5′-TCATGCCCAGAACCGAGTTG-3′，反義鏈5′-GGCTTCATCCATGGGACACA-3′，產物長度148 bp。TNF-α引物序列：正義鏈5′-GCTCCCTCTCATCAGTTCCA-3′，反義鏈5′-GCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3′，產物長度102 bp。β-actin引物序列：正義鏈5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，反義鏈5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，產物長度165 bp。取2 μL合成的cDNA產物及相應的上下游引物加入SuperReal PreMix Plus實時熒光定量PCR反應體系中，總反應體系為20 μL ，擴增條件為95 ℃預變性15 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s共40個循環，β-actin作為內參。以β-actin基因的表達量作為內參來校正目的基因的表達量，每個標本做3個復孔，取平均值，結果以2-ΔΔCT表示。RT-PCR引物序列由上海生工生物工程技術公司設計、合成。

2 結果

2.1 各組內臟脂肪組織瘦素、脂聯素、抵抗素和TNF-α蛋白表達比較 瘦素、脂聯素、抵抗素和TNF-α均在脂肪細胞胞質表達，棕黃色顆粒散在分布，細胞核內幾乎沒有表達。與假手術組相比，去卵巢組和OVXH組內臟脂肪組織瘦素蛋白表達降低，脂聯素、抵抗素及TNF-α蛋白表達均增強(P<0.05或<0.01)。與去卵巢組相比，OVXH組內臟脂肪組織抵抗素及TNF-α蛋白表達均增強(P均<0.05)。見表1。

表1 各組內臟脂肪組織瘦素、脂聯素、抵抗素和TNF-α蛋白表達比較

注：與假手術組相比，*P<0.05，#P<0.01；與去卵巢組相比，△P<0.05。

2.2 各組內臟脂肪組織瘦素、脂聯素、抵抗素和TNF-α mRNA表達比較 去卵巢組和OVXH組內臟脂肪組織脂聯素、抵抗素和TNF-α mRNA表達水平高于假手術組(P<0.05或<0.01)，OVXH組內臟脂肪組織抵抗素和TNF-α的mRNA表達水平均高于去卵巢組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組內臟脂肪組織瘦素、脂聯素、抵抗素和TNF-α mRNA表達比較

注：與假手術組相比，*P<0.05，△P<0.01；與去卵巢組相比，#P<0.05。

3 討論

絕經后女性超重和肥胖特別是中心性肥胖的發病率顯著升高，這種絕經后女性脂肪組織的再分布可促進一系列代謝性疾病的發生，特別是使代謝綜合征患病率顯著增加[6]，與之相對應的心血管疾病發病風險也顯著增高。絕經后女性雌激素缺乏與絕經后體脂增加、體脂分布密切相關[7]。有研究顯示，雌激素缺乏可通過影響糖脂代謝關鍵酶的活性，以及調控胰島素信號轉導通路的不同環節，進而誘導或加重胰島素抵抗[8～10]。此外，雌激素缺乏可直接或間接作用下丘腦，進而通過調控機體物質和能量代謝[11]，增強機體對肥胖和代謝綜合征的易感性。胰島素抵抗是代謝綜合征發病的中心環節，與代謝有關的炎癥因子增多是代謝綜合征發生發展的關鍵。脂肪組織作為一個活躍的內分泌器官，在胰島素抵抗、代謝綜合征的發生中發揮重要作用。肥胖可造成脂肪組織及肝臟等臟器的脂肪堆積和巨噬細胞浸潤，產生大量的促炎因子和脂肪因子，如瘦素、脂聯素、抵抗素、TNF-α、IL-6等，這些細胞因子可通過影響攝食中樞和調節機體胰島素敏感性，干擾包括胰島素信號傳導通路在內的多種代謝通路，從而導致胰島素抵抗[12～16]。

瘦素主要由白色脂肪組織合成和分泌的，其最主要功能是調節機體的能量平衡。當機體脂肪含量上升時，脂肪組織可分泌大量瘦素，激活下丘腦-神經肽通路，進而發揮減低食欲、增加耗能、降低體質量的作用。研究顯示，雌激素可提高大鼠血液循環中瘦素和脂肪組織中瘦素的表達，從而起到抑制食欲，減少大鼠攝食量的作用[17]。本研究發現，去卵巢組和OVXH組內臟脂肪組織瘦素蛋白表達降低，提示去卵巢后大鼠內臟脂肪組織瘦素蛋白表達明顯減弱，可能與去卵巢后造成的性激素水平降低有關，與Fungfuang等[18]研究一致。

脂聯素是由脂肪細胞分泌的一種糖蛋白，參與了血脂、血糖代謝以及炎癥病理過程，在代謝綜合征及拮抗動脈粥樣硬化方面有重要作用。研究發現，絕經后女性血清脂聯素水平顯著高于絕經前女性，無論絕經與否，肥胖者均具有較低的脂聯素水平，提示血清低脂聯素與代謝綜合征相關組分密切相關[19]。本研究發現，去卵巢組、OVXH組大鼠內臟脂肪組織脂聯素蛋白表達高于假手術組，且OVXH組內臟脂肪組織脂聯素蛋白表達高于去卵巢組，去卵巢和高脂飲食誘導大鼠模型脂肪組織脂聯素呈高分泌模式，這與絕經后女性血清低脂聯素水平不一致[19]，具體機制還有待進一步研究。

抵抗素是由白色脂肪特異分泌的一種富含半胱氨酸的蛋白質。抵抗素可通過作用于胰島素受體和胰島素受體底物、上調細胞因子信號轉導等途徑降低組織對胰島素的敏感性，從而導致胰島素抵抗的發生[20]。絕經后代謝綜合征女性抵抗素水平顯著增高，特別是與血脂異常和中心型肥胖密切相關[21]。本研究發現，去卵巢組、OVXH組大鼠內臟脂肪組織抵抗素蛋白及mRNA表達均高于假手術組，且OVXH組抵抗素蛋白及mRNA表達高于去卵巢組，提示去卵巢大鼠體脂分布異常可通過脂肪組織抵抗素的高表達，以降低組織胰島素敏感性，誘導胰島素抵抗，參與代謝綜合征的發生。

TNF-α是一種多功能的細胞因子，它除了激活白細胞，介導內毒素性休克、調節炎癥及免疫反應外，脂肪組織TNF-α的高表達與胰島素抵抗、BMI密切相關。研究顯示，脂肪細胞分泌的TNF-α進入血液后可以通過胰島素受體抑制酪氨酸激酶的活性，使葡萄糖轉運受阻，導致胰島素抵抗[22]。無論男女，代謝綜合征患者血清中TNF-α的水平明顯增高[23]。本研究發現，去卵巢組、OVXH組大鼠內臟脂肪組織TNF-α蛋白及mRNA表達均高于假手術組，且OVXH組內臟脂肪組織TNF-α蛋白及mRNA表達高于去卵巢組，提示去卵巢大鼠體脂分布異常可通過脂肪組織TNF-α高表達，誘導胰島素抵抗，參與代謝綜合征的發生。

綜上所述，去卵巢后雌性大鼠可出現體脂分布異常，內臟脂肪細胞脂聯素、抵抗素和TNF-α的表達顯著增強，瘦素表達顯著減弱，高脂飲食可進一步增加對以上脂肪因子的影響，提示絕經后的體脂分布異常可導致內臟脂肪組織的脂肪因子及TNF-α表達異常，可能與絕經后代謝綜合征的發病有關。

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山東省青島經濟技術開發區重點科技發展計劃項目(2013-1-83)。

翟木緒(E-mail: mxzhai@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.46.008

R589.2；R711.5

A

1002-266X(2016)46-0031-04

2016-03-27)