骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基因表達(dá)譜的芯片研究

摘要：目的 通過對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基因表達(dá)譜的芯片研究，為我國(guó)骨關(guān)節(jié)炎疾病治療水平的提升奠定基礎(chǔ)。方法 選取我院2013年收治的3例骨關(guān)節(jié)炎患者，將患有關(guān)節(jié)置換術(shù)的骨關(guān)節(jié)患者，當(dāng)做骨關(guān)節(jié)組（第一組）、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者當(dāng)做RA組（第二組）、沒有關(guān)節(jié)炎有創(chuàng)傷的患者，當(dāng)做是創(chuàng)傷組（第三組），進(jìn)行軟骨標(biāo)本、細(xì)胞培養(yǎng)，利用微陣列差異性基因分析軟件，分析骨關(guān)節(jié)組，分別與剩下兩組軟骨細(xì)胞的差異性，以及差異性基因的性質(zhì)。結(jié)果 一、三組的差異基因有133個(gè)，包含的上調(diào)和下調(diào)分別是65個(gè)、68個(gè)；一、二組的差異基因有293個(gè)，包含的上調(diào)和下調(diào)分別是106個(gè)、187個(gè)。第一組與其余兩組的差異性基因功能，屬于生物調(diào)節(jié)等，差異性基因的通路，符合統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05的包括細(xì)胞周期通路、一氧化氮通路等。但同時(shí)三組配對(duì)的差異性基因，既存在差異性，同時(shí)也存在相互性。結(jié)論 從差異性基因的多角度入手分析其骨關(guān)節(jié)炎的生物信息，為以后骨關(guān)節(jié)，從基因表達(dá)方面進(jìn)行治療，有了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：骨關(guān)節(jié)炎；關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞；基因表達(dá)譜芯片技術(shù)

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的疾病，但是治療的過程和效果卻沒有達(dá)到理想狀態(tài)，主要原因是由于該種疾病的發(fā)病原因多樣，且病情程度不同，給治療帶影響；而采用基本表達(dá)譜芯片技術(shù)，對(duì)于患者的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，與對(duì)照樣品和芯片進(jìn)行雜交，使其產(chǎn)生差距性基因，通過對(duì)于差異性基因的功能、通路等生物學(xué)信息特征進(jìn)行分析，從而更好的檢測(cè)基因表達(dá)水平的變化，有效的識(shí)別多基因，參與的雜交疾病；對(duì)此加強(qiáng)此方面的研究，更能確定其骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病原理，為以后骨關(guān)節(jié)疾病的根治提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料 選取我院2013年收治的3例骨關(guān)節(jié)炎患者，將患有關(guān)節(jié)置換術(shù)的骨關(guān)節(jié)患者、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者、沒有關(guān)節(jié)炎有創(chuàng)傷的患者；男性1例，女性2例，年齡分別是64歲、56歲和45歲；在患者同意之下，按照各個(gè)符合分類標(biāo)準(zhǔn)的三組患者，分別分為骨關(guān)節(jié)組（第一組）、RA組（第二組）以及創(chuàng)傷組（第三組）作為研究的對(duì)象。

1.2方法

1.2.1選取指定的基因表達(dá)譜芯片，其中芯片中，含有指定數(shù)量的看家基因，作為陰性、陽性的對(duì)照，以及外標(biāo)探針。

1.2.2軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法 標(biāo)本的制作，利用胰蛋白酶0.25%、膠原酶0.2%Ⅳ消化軟骨進(jìn)行切片，然后在37.5℃左右溫度下的溫浴4 h，并將細(xì)胞進(jìn)行篩選，以及離心過濾，過濾的時(shí)間為5 min左右，離心轉(zhuǎn)速為1500 r/min，將上層的清液去除。利用標(biāo)準(zhǔn)型的DNEM培養(yǎng)液進(jìn)行清洗；在吹打的過程中，要注意泡沫對(duì)于混勻效果的影響，同時(shí)進(jìn)行離心過濾，并使其細(xì)胞密度在4×105；將其接種在培養(yǎng)瓶中，在體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳、恒溫37.5℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 RNA的提取 利用TRIZOL總RNA抽提試劑進(jìn)行抽取[2]，在應(yīng)用的過程中，避免有毒性的TRIZOL試劑弄到皮膚或是眼睛上。其RNA的濃縮，采用異丙醇進(jìn)行沉淀；當(dāng)確定后樣品中的RNA量時(shí)，利用RNase-free water，將樣品調(diào)整至體積為100 μl[1]，并將其進(jìn)行離心，達(dá)到洗脫RNA的目的，并進(jìn)行定量和電泳質(zhì)檢。最后對(duì)于RNA進(jìn)行熒光標(biāo)記。

1.2.4芯片技術(shù)應(yīng)用 首先將標(biāo)記好的DNA，與由SSC、SDS、DENHART與指定濃度甲酰胺組成的混合液，取80 μl使其進(jìn)行雜交，之后在由指定溫度，以及濃度SSC、SDS混和成的混合液中，和SSC溶液進(jìn)行清洗，最后利用指定的雙通道激光掃描儀進(jìn)行掃描。之后利用laxScan3.0圖像分析軟件，根據(jù)圖像質(zhì)量程度和信號(hào)，對(duì)于基因進(jìn)行標(biāo)記，將其幾組熒光信號(hào)強(qiáng)度的比值，輸入到微陣列差異性軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SAM基因芯片分析軟件，進(jìn)行差異性基因的挑選，當(dāng)P<0.05時(shí)，則說明差異符合統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[3]。

2結(jié)果

一、三組的差異基因有133個(gè)，包含的上調(diào)和下調(diào)分別是65個(gè)、68個(gè)；一、二組的差異基因有293個(gè)，包含的上調(diào)和下調(diào)分別是106個(gè)、187個(gè)。第一組與其余兩組的差異性基因功能，屬于生物調(diào)節(jié)等，差異性基因的通路，符合統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05的包括細(xì)胞周期通路、一氧化氮通路等。第一組與二、三組表達(dá)基因的基因功能的分類，其中細(xì)胞過程差異性基因，第二組占到14.4%，第三組占到14.8%；生理過程差異性基因，第二組占到12.3%，第三組占到13.9%；生物調(diào)節(jié)差異性基因，第二組占到8.2%，第三組占到7.3%；生物調(diào)節(jié)過程差異性基因，第二組占到7.6%，第三組占到6.7%；代謝差異性基因，第二組占到5.5%，第三組占到5.6%；細(xì)胞成分差異性基因，第二組占到5.4%，第三組占到4.8%；細(xì)胞差異性基因，第二組占到5.4%，第三組占到4.8%；結(jié)合差異性基因，第二組占到4.3%，第三組占到4.1%。其中部分差異基因通路見表1。

3討論

對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨功能分析，有利于醫(yī)療水平的提升，因?yàn)橐坏┘?xì)胞功能出現(xiàn)問題，就會(huì)導(dǎo)致其細(xì)胞出現(xiàn)死亡、損傷、因子異常等情況的出現(xiàn)，同時(shí)細(xì)胞因子，對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨具有一定的刺激作用，對(duì)此加強(qiáng)此方面的研究，有利于對(duì)于關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)理的研究。

本文采用SAM基因芯片分析的方法，將關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的全基因表達(dá)譜進(jìn)行深入的研究，一些下調(diào)基因PSME2、VCAM1等生物學(xué)特征等信息，可以更好的發(fā)現(xiàn)以往沒有發(fā)現(xiàn)的致病原因，多增加一些治療的方式，從而更好的拯救骨關(guān)節(jié)炎患者的疾病。

綜上所述，通過對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基因表達(dá)譜的芯片研究分析，發(fā)先第一組與第二組，比到一組與第三組，在差異性因數(shù)的數(shù)量上和信息上，要豐富的多，并表明了骨關(guān)節(jié)炎，退行性病變的發(fā)病過程，比免疫機(jī)制所導(dǎo)致的老年人風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，以較大的差距。同時(shí)通過這兩組差異基因通路的研究，發(fā)現(xiàn)兩組在凋亡通路、細(xì)胞周期通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路、硫酸軟骨生物合成通路等多種通路上，都有明顯的差異，像JaK-STAT信號(hào)通路方面，第一組與第三組的參與基因是STAT2、PIK3CD；而第一組與第二組的參與基因卻是IRF9、IL11，且P<0.05，說明這兩組的差異基因的功能、通路，不僅存在一定的差異，與此同時(shí)，與存在一定交叉關(guān)系。

參考文獻(xiàn)：

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[3]夏澤楠.骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨祖細(xì)胞功能活性及miRNA表達(dá)譜的改變[D].北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2014.編輯/孫杰