膝關節骨關節炎患者外周血脂聯素基因+45T/G和+267G/T單核苷酸多態性觀察

向東，唐茂丹，陳翰博，詹東

(1 昆明醫科大學第二附屬醫院，昆明650101；2 昆明理工大學醫學院人體解剖學教研室；3昆明醫科大學基礎醫學院實驗教學中心)

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膝關節骨關節炎患者外周血脂聯素基因+45T/G和+267G/T單核苷酸多態性觀察

向東1，唐茂丹2，陳翰博1，詹東3

(1 昆明醫科大學第二附屬醫院，昆明650101；2 昆明理工大學醫學院人體解剖學教研室；3昆明醫科大學基礎醫學院實驗教學中心)

目的 觀察膝關節骨關節炎(OA)患者外周血脂聯素基因+45T/G和+267G/T單核苷酸多態性。方法 255例膝關節OA患者為觀察組，201例健康志愿者為對照組。抽取兩組外周靜脈血 5mL，采用PCR-限制性片段長度多態性法測定外周血脂聯素基因+45T/G和+267G/T位點的單核苷酸多態性。結果 兩組外周血脂聯素基因+45T/G和+267G/T位點SNP均符合HWE平衡。觀察組外周血脂聯素基因+45T/G、+267G/T等位基因T、G頻率分別為64.6%和35.4%、29.2%和70.8%，與對照組相比，P均>0.05。輕度、中重度膝關節OA患者外周血脂聯素基因+267G/T位點等位基因T、G頻率32.9%和67.1%、24.1%和75.9%相比，P均<0.05。結論 中重度膝關節OA患者外周血脂聯素基因+267G/T位點上多為GG型基因或攜帶等位基因G。

骨關節炎；膝關節骨關節炎；脂聯素；基因多態性；單核苷酸多態性

骨關節炎(OA)是一種慢性退行性關節病，常見于膝關節、髖關節、脊柱等承重關節，老年人和女性為其好發人群。主要臨床表現為關節功能減弱、滑膜炎、關節周圍骨贅形成、關節腔變窄、軟骨下骨硬化和關節軟骨進行性破壞，目前尚無有效治療方法。深入研究OA的發病原因和機制對其治療有重要意義。生長分化因子5(GDF 5)[1]、白介素-1β(IL-1β)[2]、白介素-6(IL-6)[3]、基質金屬蛋白酶-3(MMP 3)[4]等基因的核苷酸多態性與骨關節炎發病密切相關。脂聯素是一種只在脂肪細胞表達的激素，參與肥胖、糖尿病、冠心病等疾病的發生發展，同時其還具有抗炎作用。研究發現，膝關節OA患者血漿脂聯素水平明顯高于健康對照者[5]，關節液脂聯素水平與膝關節炎嚴重程度呈負相關[6]。人類脂聯素基因位于染色體3q27，全長17 kb，包括3個外顯子，多個單核苷酸多態性位點與BMI、肥胖等代謝性疾病密切相關，但位于2號外顯子的+45T/G(rs2241766)和位于2號內含子的+267G/T (rs1501299)單核苷酸多態性與OA相關性方面報道較少。2011年6月～2015年1月，我們觀察了膝關節OA患者外周血脂聯素基因+45T/G和+267G/T單核苷酸多態性,現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2011年6月～2015年1月間昆明醫科大學第二附屬醫院收治的膝關節OA患者(觀察組)255例，其中男39例、女216例，年齡(64.2±6.7)歲，BMI 24.76±3.84，腰圍(74.6±8.3)cm，臀圍(86.9±9.1) cm，腰臀比0.86±0.2。膝關節OA納入標準為1995年美國風濕病協會修訂的膝關節OA診斷標準，其中病情輕度(KL評分2分)68例、中度(KL評分3分)94例、重度(KL評分4分)93例、中重度(KL評分>2分)187例。排除標準為患有繼發性OA和其他類型關節炎、系統炎癥、免疫系統疾病、慢性疾病、腫瘤和已行手術治療者。另選擇201例健康志愿者為對照，其中男68例、女133例，年齡(65.2±6.7)歲，BMI 26.87±3.15，腰圍(92.8±7.9) cm，臀圍(97.3±9.3) cm，腰臀比0.95±0.2，均未出現OA和其他類型關節炎的癥狀和體征，無OA家族史，無痛風、系統性紅斑狼瘡、銀屑病、血色病，既往無關節感染和關節外傷。兩組性別、BMI、腰圍、臀圍和腰臀比間差異具有統計學意義。本研究經昆明醫科大學第二附屬醫院倫理委員會批準。納入者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 膝關節患者外周血脂聯素基因+45T/G 和+267G/T位點SNP觀察 清晨抽取兩組外周靜脈血 5 mL，離心后采用Illustra Blood GenomicPrep Midi Flow試劑盒提取DNA，采用PCR-限制性片段長度多態性法(PCR-RFLP)測定脂聯素基因+45T/G 和+267G/T位點。+45T/G上游引物序列為5′-TCCTTTGTAGGTCCCAACT-3′，下游引物序列為5′-GCAGCAAAGCCAAAGTCTTG-3′。+267G/T上游引物序列為5′-ACACTGATATAAACGCCATGAA-3′，下游引物序列為5′-GCAGCAAAGCCAAAGTCTTC-3′[7]。+45T/G 反應條件為：95 ℃、15 min；95 ℃、30 s， 56 ℃、30 s，72 ℃、60 s循環35次；72 ℃延伸7 min。PCR擴增產物用限制性核酸內切酶BspH1 37 ℃水浴消化16 h，2.5%瓊脂糖明膠電泳，溴化乙錠染色后紫外線觀察。+267G/T反應條件為：95 ℃、10 min；95 ℃、30 s, 48 ℃、60 s, 72 ℃、60 s循環40次；72 ℃、7 min。PCR擴增產物用限制性核酸內切酶BgⅡ 37 ℃水浴消化16 h，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴化乙錠染色后紫外線觀察。

1.3 統計學方法 采用SPSS21.0統計軟件進行統計學分析。分析樣本基因頻率是否符合哈迪-溫伯格平衡(HWE)采用 Michael H Courts (2005～2008) 在線分析程序(www.coursehero.com)。采用直接計數法計算基因型及等位基因頻率，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

兩組外周血脂聯素基因+45T/G 和+267G/T 位點SNP均符合HWE平衡。觀察外周血組脂聯素基因+45T/G為TT基因型105例(41.2%)、TG基因型120例(47.1%)、GG基因型30例(11.8%)，T等位基因頻率64.6%，G等位基因頻率35.4%。對照組外周血脂聯素基因+45T/G為TT基因型98例(48.8%)、TG基因型78例(38.8%)、GG基因型25例(12.4%)，T等位基因頻率68.2%，G等位基因頻率31.8%。兩組間基因型及等位基因頻率間差異均無統計學意義(P均>0.05)。

觀察組外周血脂聯素基因+267G/T為GG基因型130例(51.0%)、GT基因型101例(39.6%)、TT基因型24例(9.4%)，G等位基因頻率70.8%，T等位基因頻率29.2%。對照組外周血脂聯素基因+267G/T為GG基因型103例(51.2%)、GT基因型81例(41.3%)、TT基因型17例(8.5%)，G等位基因頻率71.4%，T等位基因頻率28.6%。兩組間基因型及等位基因頻率間差異均無統計學意義(P均>0.05)。

不同病情程度膝關節OA患者外周血脂聯素基因+45T/G 和+267G/T 基因型見表1。輕度和中重度骨關節患者外周血脂聯素基因SNP +267G/T位點的基因頻率存在差異(P=0.012)，中重度骨關節炎患者組的GG型基因更多；相同位點等位基因頻率也存在統計學差異(P=0.041)，中重度骨關節炎患者組含有更多的等位基因G。+45T/G位點組間差異均無統計學意義(P均>0.05)。輕、中、重和中重度膝關節OA患者外周血脂聯素基因+45T/G位點T等位基因頻率28.2%、36.4%、35.4%和71.8%, G等位基因頻率23.9%、37.8%、38.3%和76.1%，輕、中、重和中重度膝關節OA患者外周血脂聯素基因+267G/T位點G等位基因頻率分別為24.1%、38.5%、37.4%和75.9%, T等位基因頻率32.9%、32.95、34.2%和67.1%。

表1 不同病情程度膝關節OA患者外周血脂聯素基因+45T/G 和+267G/T 基因型

3 討論

OA致病因素分為影響關節生物力學負重的局部因素(如生物力學、運動和肥胖等)和與OA發展相關的系統因素(如衰老、性別和遺傳等)[8]。衰老可使關節軟骨退化而致OA發生[9]，本研究患者年齡50～80歲，平均(65.2±6.7)歲，與以往報道的發病年齡一致；以女性患者(絕經)為主，說明女性激素變化會增加患病危險[10]。OA組BMI值顯著高于對照組，提示肥胖是危險因素，而BMI并不能反映脂肪和骨骼肌質量的變化[11]。Lee等[12]的研究表明肌減少癥性肥胖比非肌減少癥性肥胖與OA發病相關性更強，腰臀比是肌減少癥性肥胖指標之一，OA組腰臀比顯著高于對照組。

既往研究發現，膝關節OA患者關節滑膜液中脂聯素水平和病情嚴重程度呈負相關[6]，但膝關節OA患者關節滑膜液中脂聯素水平與健康對照者差異無統計學意義[13]。促炎趨化因子TNF-α對脂聯素有負調控作用；通過降低NF-κB 活性，脂聯素還可減少被LPS刺激的巨噬細胞表達TNF-α[14]，從而降低巨噬細胞在炎癥反應中的作用。脂聯素不僅具有抗炎功能，在代謝方面也具有積極的功能。體內和體外實驗發現，成骨細胞和軟骨細胞不僅表達脂聯素還表達脂聯素受體[15～17]， 通過自分泌或者旁分泌，脂聯素作用于成骨細胞上的脂聯素受體1和AMPK信號通路，誘導成骨細胞和軟骨細胞的增生、分化、生物礦化，還促進細胞Ⅱ、Ⅹ型膠原蛋白，糖蛋白的合成和表達。同時，脂聯素基因核苷酸多態性研究多見于國內外報道，并與多種疾病相關，主要包括代謝綜合征、2型糖尿病、肥胖、冠心病等與代謝相關的疾病。但國內還未見脂聯素基因核苷酸多態性與骨關節炎的相關性研究，而且由于人群和種族的差異，結果可能并不完全相同。所以有必要對我國漢族人群進行本項研究。筆者選取了研究脂聯素基因核苷酸多態性較為普遍的位點：+45T/G(rs2241766)和+267G/T (rs1501299)。SNP+45位點等位基因突變T→G或+267位點等位基因G攜帶者脂聯素表達降低，從而減弱脂聯素在抗炎中的作用；抑制外周組織對葡萄糖的攝取和利用，增高血糖，導致糖和脂肪代謝失衡[18,19]。本研究結果中，脂聯素基因SNP+45T/G和+267G/T位點的基因型和等位基因頻率分布上，對照組與觀察組無統計學差異。但是，OA患者病情嚴重程度按KL評分分組后，在中重度組(KL評分>2分)與輕度組(KL評分=2分)之間，SNP+267G/T位點的基因型和等位基因頻率都出現了統計學差異。由此筆者推測SNP+267G/T位點的基因型GG和等位基因G與骨關節炎的疾病發生和危險因素無相關性，但與OA發病后疾病發展和其嚴重程度有關。多種混合因素導致OA發病后，在脂聯素基因SNP+267G/T位點上G等位基因(優勢等位基因)能夠降低患者脂聯素的表達，減弱脂聯素的抗炎作用，促進軟骨和滑膜炎癥反應，導致軟骨細胞功能障礙、軟骨無法再生，滑膜細胞不能正常分泌透明質酸、關節面摩擦增大；同時抑制外周組織攝取和利用葡萄糖，增高血糖，導致糖和脂肪代謝障礙,關節液成分變化，影響關節軟骨代謝，使得缺損的軟骨無法及時修復。加重骨關節炎的嚴重程度，提高了KL評分，使輕度OA患者更可能發展為中重度患者。在SNP+45位點非優勢等位基因G與機體脂聯素表達相關，然而64.6%的OA患者攜帶與脂聯素表達不相關的優勢等位基因T，因此，未發現SNP+45位點與OA或其病情程度的相關性。但SNP+267G/T如何影響脂聯素基因功能仍不十分清楚，它可能和其他變異的脂聯素基因或與脂聯素基因相接近的基因發生連鎖不平衡，從而影響脂聯素在血清中的表達。研究人員已經發現，位于3′非編碼區(UTR)SNP+2019位點插入的堿基“A”可以和SNP+267G/T位點的堿基發生完全的連鎖不平衡，而3′UTR一直被認為是調控脂聯素基因表達的重要因子，具有核心地位，在3′UTR SNP+2019位點插入堿基就會影響mRNA的轉錄、翻譯和降解[20]。而且大多數基因中，3′UTR的多態性會直接影響mRNA的穩定性，脂聯素基因3′UTR可能也具有相似的功能。

綜上所述，中重度膝關節OA患者脂聯素基因+267G/T位點上多為GG型基因或攜帶等位基因G。脂聯素基因+267G/T位點上的基因型為GG或等位基因為G的膝關節OA患者病情更易進展為中重度。

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《山東醫藥》對醫學名詞及術語的一般要求

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Observation of +45T/G and +267G/T single nucleotide polymorphisms of adiponectin gene in patients with knee osteoarthritis

XIANGDong1,TANGMaodan,CHENHanbo,ZHANDong

(1TheSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650101,China)

Objective To observe the single nucleotide polymorphisms (SNPs) of +45T/G and +267G/T loci in adiponectin gene of patients with knee osteoarthritis (OA). Methods The genotypes and allele frequencies of SNPs of +45T/G and +267G/T loci in adiponectin gene from plasma of 255 knee OA patients (observation group) and 201 healthy volunteers (control group) were detected with polymerase chain reaction-based restriction fragment-length polymorphism (PCR-RFLP). Results Two SNPs met Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE). T and G allele frequencies of +45T/G and +267G/T loci of adiponectin gene were respectively 64.6%, 35.4%, and 29.2%, 70.8% in the observation group, and no significant difference was found as compared with that of the control group (allP>0.05). But there was statistic difference between low-grade group and moderate to severe-grade group of OA patients at SNP +267G/T locus (32.9%, 67.1% and 24.1%,75.9%) (allP<0.05). Conclusion At the +267G/T locus of adiponectin gene of moderate to severe-grade OA patients, there are more GG genotype or carrying G allele.

osteoarthritis; knee osteoarthritis; adiponectin; gene polymorphism; single nucleotide polymorphisms

向東(1973-)，男，主治醫師，主要研究方向為骨創傷、骨關節炎、急診外科。E-mail:dor_xiang_km@sina.com

簡介：詹東(1984-)，男，碩士學位，主要研究方向為關節炎、單核苷酸多肽性、外科手術入路。E-mail:237476375@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.39.007

R394

A

1002-266X(2016)39-0023-04

2016-05-18)