介入化療栓塞治療對(duì)原發(fā)性肝癌患者細(xì)胞免疫功能的影響

厲英超，米 琛，薛 揮，李偉之，李培杰，呂良山

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，西安 710061)

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論著·臨床研究

介入化療栓塞治療對(duì)原發(fā)性肝癌患者細(xì)胞免疫功能的影響

厲英超，米 琛，薛 揮，李偉之，李培杰，呂良山

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，西安 710061)

目的 探討經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞治療(TACE)對(duì)原發(fā)性肝癌患者細(xì)胞免疫功能的影響。方法 對(duì)89例原發(fā)性肝癌患者行TACE治療，TACE所用藥物為：阿霉素40～60mg，5-氟尿嘧啶1 000～1 250mg，奧沙利鉑150～200mg，亞葉酸鈣300mg，碘化油平均用量10mL。分別于治療前及治療后4周取外周血2mL，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及CD4+/CD8+比值，并與30例健康人相對(duì)照。結(jié)果 與健康對(duì)照組比較，原發(fā)性肝癌患者CD3+、CD4+及CD4+/CD8+比值明顯降低(P<0.05),分別為(33.2±17.5)%、(14.2±7.1)%和0.87±0.53。TACE治療4周后CD3+、CD4+均高于治療前，CD8+較治療前下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而CD4+/CD8+比值升至1.98±0.72，明顯高于治療前(P<0.05)。結(jié)論 原發(fā)性肝癌患者細(xì)胞免疫功能低下，TACE治療可促進(jìn)患者的T淋巴細(xì)胞免疫功能恢復(fù)。

肝腫瘤；T淋巴細(xì)胞亞群；細(xì)胞免疫；化療栓塞；介入治療

原發(fā)性肝癌是世界上病死率最高的五大腫瘤之一，其發(fā)病率近年來(lái)呈不斷升高的趨勢(shì)。原發(fā)性肝癌惡性度高，病變進(jìn)展快，大多數(shù)患者就診時(shí)已是中晚期，介入化療栓塞治療(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)成為目前治療中晚期原發(fā)性肝癌的主要方法[1-2]。原發(fā)性肝癌患者常常出現(xiàn)細(xì)胞免疫功能低下，細(xì)胞免疫功能異常對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸都有著重要的影響，而TACE治療能否促進(jìn)細(xì)胞免疫功能的恢復(fù)，從而進(jìn)一步達(dá)到抑制腫瘤的效果，臨床研究尚未得到一致的結(jié)果。本研究采用TACE治療原發(fā)性肝癌，并通過(guò)對(duì)比治療前后T淋巴細(xì)胞亞群的變化，試圖闡明TACE對(duì)原發(fā)性肝癌患者細(xì)胞免疫功能的影響，并進(jìn)一步探討其在疾病轉(zhuǎn)歸中的重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年5～10月，本院消化內(nèi)科行TACE治療的89例原發(fā)性肝癌患者(男71例，女18例，年齡25～78歲，平均51歲)均經(jīng)臨床、影像學(xué)及血清甲胎蛋白(AFP)檢測(cè)或穿刺活檢確診，經(jīng)胸部透視、骨掃描、CT或MRI排除肺轉(zhuǎn)移和骨轉(zhuǎn)移。均按國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期。全部患者均未使用免疫制劑。TACE后4周再次復(fù)查AFP。選擇健康對(duì)照者30例，男20例，女10例，年齡20～50歲，平均34歲，均為健康獻(xiàn)血員。

1.2 介入方法 采用Seldinger技術(shù)，先行常規(guī)腸系膜上動(dòng)脈間接門脈造影及腹腔動(dòng)脈造影，再做腫瘤供血?jiǎng)用}選擇性和超選擇性插管，灌注化療藥物：阿霉素40～60 mg，5-氟尿嘧啶1 000～1 250 mg，奧沙利鉑150～200 mg，亞葉酸鈣300 mg。使用碘化油進(jìn)行栓塞，劑量根據(jù)病灶大小及術(shù)中患者耐受情況而異，為5～30 mL，平均用量10 mL。

1.3 細(xì)胞免疫功能測(cè)定 TACE治療前及治療后4周，分別取89例原發(fā)性肝癌患者清晨空腹外周靜脈血2 mL，另取30例健康人清晨空腹外周靜脈血2 mL相對(duì)照。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞免疫功能：取外周靜脈血(乙二胺四乙酸抗凝)2 mL，加入2 mL淋巴細(xì)胞分離液，1 500 r/min離心10 min，提取其中淋巴細(xì)胞層，再以2 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，同速離心2次，棄上清液后，將細(xì)胞懸液分入試管，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為106/mL。分別加入CD3+、CD4+、CD8+單抗工作液和陰性對(duì)照單抗IgG 120 μL，均避光反應(yīng)30 min，2 000 r/min離心15 min，用2 mL PBS漂洗，再同速離心漂洗1次，均棄上清液，最后加入PBS 500 μL待測(cè)。上機(jī)前以標(biāo)準(zhǔn)熒光微球調(diào)整儀器的變異系數(shù)并穩(wěn)定在2%以內(nèi)，上機(jī)后收集2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，熒光強(qiáng)度以對(duì)數(shù)放大，測(cè)定完成后用Cell Quest Plot軟件分析數(shù)據(jù)。

1.4 儀器與試劑 FAC Scan型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)、BIO450型酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)、異硫氰酸熒光素(FITC)或藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的鼠抗人CD3+、CD4+、CD8+單抗(法國(guó)Immunotech公司產(chǎn)品)。

2 結(jié) 果

2.1 原發(fā)性肝癌患者TACE治療前后T淋巴細(xì)胞亞群變化 原發(fā)性肝癌患者TACE治療前與健康對(duì)照組比較，CD3+、CD4+及CD4+/CD8+比值均明顯降低(P<0.05)，CD8+也低于健康對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TACE治療后4周，CD3+、CD4+均高于治療前，而CD8+較治療前下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而CD4+/CD8+比值明顯高于治療前(P<0.05)，見表1及圖1。

表1 原發(fā)性肝癌患者TACE治療前后T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果

a：P<0.05,與健康對(duì)照組比較；b：P<0.05，與TACE治療前比較。

圖1 TACE治療前后T淋巴細(xì)胞亞群的變化

2.2 原發(fā)性肝癌患者TACE治療前后T淋巴細(xì)胞亞群分布 經(jīng)CellQuest軟件分析處理，治療組患者在TACE術(shù)前、術(shù)后4周的T細(xì)胞亞群分布變化見圖2，TACE治療后4周，CD4+細(xì)胞比例較治療前升高，而CD8+細(xì)胞比例較治療前降低。

圖2 原發(fā)性肝癌患者TACE治療前后T淋巴細(xì)胞亞群分布圖

2.3 原發(fā)性肝癌患者TACE治療前后AFP變化 在TACE治療前，89例原發(fā)性肝癌患者中，有73例AFP高于正常值，陽(yáng)性率82.0%，平均值為(1 874±835)μg/L。TACE治療后4周復(fù)查AFP為(327±181)μg/L，較TACE治療前明顯下降(P<0.05)。

3 討 論

原發(fā)性肝癌的發(fā)生與機(jī)體的免疫狀況，特別是T淋巴細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫密切相關(guān)。隨著介入治療在中晚期肝癌治療策略中地位的日益突出，細(xì)胞免疫狀態(tài)也將成為介入治療的重要內(nèi)容和研究方向之一[3-4]。

T淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫監(jiān)視及抗腫瘤免疫的重要效應(yīng)細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞來(lái)源于骨髓的淋巴樣干細(xì)胞，在胸腺內(nèi)發(fā)育成熟為T細(xì)胞，移行至外周淋巴組織，執(zhí)行特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。外周成熟的T細(xì)胞(CD3+、總T細(xì)胞)按表面分子或功能不同可分為不同的亞群。按其表面CD分子的不同可分為CD4+、CD8+兩大亞群。正常情況下，CD4+和CD8+之間始終保持一個(gè)恒定的比例，構(gòu)成宿主細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的重要環(huán)節(jié)。任何一方過(guò)低或過(guò)高，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)失去平衡均可引起免疫紊亂。因CD4+有誘導(dǎo)和輔助功能，一般認(rèn)為處于細(xì)胞免疫的核心，而CD8+亞群含抑制性T細(xì)胞，所以當(dāng)CD4+下降、CD8+上升或CD4+/CD8+比值下降時(shí)，機(jī)體細(xì)胞免疫功能低下。腫瘤患者往往機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)低下，多表現(xiàn)為T淋巴細(xì)胞亞群異常，而腫瘤患者免疫功能的恢復(fù)或好轉(zhuǎn)首先表現(xiàn)為CD4+/CD8+比值的回升[5]。本研究89例原發(fā)性肝癌患者與健康對(duì)照組比較，總T細(xì)胞(CD3+)及各亞群(CD4+和CD8+)均下降，但由于在細(xì)胞免疫中起核心作用的CD4+下降更為明顯而導(dǎo)致CD4+/CD8+比值明顯低于正常(P<0.05)，提示原發(fā)性肝癌患者T淋巴細(xì)胞亞群異常，細(xì)胞免疫狀態(tài)低下，不能形成有效的免疫應(yīng)答，表現(xiàn)為機(jī)體清除腫瘤細(xì)胞的能力下降，使腫瘤得以持續(xù)發(fā)展。有研究表明，原發(fā)性肝癌患者細(xì)胞免疫發(fā)生不同程度的紊亂，可能與原發(fā)性肝癌誘導(dǎo)產(chǎn)生的血清免疫抑制因子有關(guān)[6]。

TACE是中晚期原發(fā)性肝癌重要的治療方法，可顯著延長(zhǎng)患者生存期，這與機(jī)體免疫功能狀態(tài)有密不可分的關(guān)系，TACE療效在機(jī)體免疫功能良好的情況下得到加強(qiáng)，復(fù)發(fā)率明顯減少[7]。盡管TACE已廣泛應(yīng)用于臨床，但其能否改善肝癌患者細(xì)胞免疫狀況，尚無(wú)定論。Higuchi等[8]研究TACE后手術(shù)切除標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，TACE不僅破壞瘤體內(nèi)的瘤細(xì)胞，而且對(duì)瘤外子灶、腫瘤包膜外浸潤(rùn)灶及門靜脈癌栓都有殺傷作用，介入治療后腫瘤內(nèi)部壞死率達(dá)35.5%～80.0%。一般認(rèn)為，TACE治療原發(fā)性肝癌在很大程度上減輕了腫瘤負(fù)荷，解除或減輕了腫瘤組織的免疫抑制作用，使機(jī)體的免疫功能恢復(fù)[9]。但也有研究得出不同的結(jié)果，認(rèn)為肝癌患者在TACE術(shù)后免疫功能至少在初始階段是受到抑制的[10]。

TACE對(duì)肝癌患者細(xì)胞免疫狀態(tài)影響的不同研究結(jié)果，可能與病例選擇(病情的輕重或早晚)[11]、化療藥物劑量(大劑量或小劑量)[12]、檢測(cè)時(shí)間(術(shù)后指標(biāo)檢測(cè)的間隔時(shí)間長(zhǎng)短)[13]等多種因素有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)TACE治療后1～2周細(xì)胞免疫水平出現(xiàn)一過(guò)性的下降，而3～4周出現(xiàn)明顯回升，故本研究將TACE術(shù)后4周選定為復(fù)查時(shí)間。本研究選擇的89例原發(fā)性肝癌病例多為中晚期肝癌的患者，均未使用大劑量的化療方案，研究結(jié)果顯示：TACE治療后4周，機(jī)體的細(xì)胞免疫功能出現(xiàn)恢復(fù)的趨勢(shì)，表現(xiàn)為總T細(xì)胞(CD3+)和起核心作用的CD4+亞群比例出現(xiàn)回升，抑制性T細(xì)胞CD8+亞群比例下降，不同亞群的CD4+與CD8+細(xì)胞呈現(xiàn)出相反的變化趨勢(shì)，提示此變化是TACE治療干預(yù)作用的結(jié)果，而非機(jī)體自然恢復(fù)所致。特別是CD4+/CD8+比值的明顯升高(P<0.05)，更被常常作為腫瘤患者免疫功能的恢復(fù)或好轉(zhuǎn)的首要表現(xiàn)。血清AFP值作為反映原發(fā)性肝癌治療效果的直接參數(shù)，也較TACE治療前明顯下降(P<0.05)。所以說(shuō)，TACE在治療腫瘤的同時(shí)，對(duì)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)也有促進(jìn)恢復(fù)的作用，即在局部治療的同時(shí)，也達(dá)到了全身治療的目的。

TACE治療包括栓塞和化療兩部分，對(duì)機(jī)體免疫功能的影響頗為復(fù)雜。國(guó)內(nèi)外有關(guān)栓塞對(duì)患者免疫功能影響的報(bào)道較少。有研究表明，介入栓塞治療后機(jī)體的細(xì)胞免疫功能得到恢復(fù)，證實(shí)了栓塞治療后原發(fā)性肝癌患者的免疫功能抑制減輕[12]。全身化療對(duì)腫瘤患者T細(xì)胞亞群的影響己有較多的報(bào)道，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為化療可抑制機(jī)體的免疫功能，但研究表明，介入化療(特別是小劑量介入化療)對(duì)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能抑制不明顯。鄒勁林等[14]觀察介入熱灌注化療對(duì)原發(fā)性肝癌患者細(xì)胞免疫功能有一定的激活作用。

原發(fā)性肝癌的惡性程度高，較早即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，肝癌的這一生物學(xué)特性決定了肝癌的治療用單一方法難以取得滿意的療效，故對(duì)手術(shù)不可切除肝癌的治療，今后多傾向于以TACE為主的綜合介入治療[15]。目前報(bào)道的綜合介入治療包括：(1)TACE聯(lián)合物理消融治療，例如TACE聯(lián)合射頻消融[16]、微波消融[17]、冷凍消融[18]、高能聚焦超聲消融等，能夠提高機(jī)體細(xì)胞免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤的免疫力。(2)TACE聯(lián)合其他介入手術(shù)方法，有研究報(bào)道，TACE聯(lián)合部分脾栓塞術(shù)較單純TACE能更好地改善機(jī)體抗腫瘤免疫功能，促進(jìn)肝癌患者免疫功能平衡的恢復(fù)[19]。(3)TACE聯(lián)合免疫治療，例如樹突狀細(xì)胞治療、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞過(guò)繼治療等，均對(duì)機(jī)體免疫功能有正向調(diào)節(jié)作用，展現(xiàn)了良好的前景。(4)TACE聯(lián)合分子靶向藥物(如索拉菲尼)，索拉菲尼具有雙重抗腫瘤作用即直接抑制腫瘤增殖和抑制腫瘤血管生成的作用，還具有提高肝癌患者免疫功能的作用。Strebel等[20]報(bào)道，TACE聯(lián)合索拉非尼治療肝癌可有效抑制腫瘤血管再生，減少腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，提高肝癌的治療效果。(5)TACE聯(lián)合中醫(yī)藥治療，此類報(bào)道較多，中醫(yī)藥治療通過(guò)改善患者免疫狀態(tài)，提高機(jī)體的抗腫瘤免疫效應(yīng)，有可能降低中晚期肝癌患者TACE術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)。

原發(fā)性肝癌患者細(xì)胞免疫功能低下，重視保護(hù)和提高患者細(xì)胞免疫功能應(yīng)該是綜合治療中的重要方面。T細(xì)胞亞群能較為準(zhǔn)確、合理地反映機(jī)體的細(xì)胞免疫功能水平，有助于觀察療效及評(píng)定患者預(yù)后。在治療原發(fā)性肝癌時(shí)，TACE可促進(jìn)患者CD4+/CD8+比值的明顯升高和細(xì)胞免疫功能的恢復(fù)。今后將有更多的以原發(fā)性肝癌患者細(xì)胞免疫功能為內(nèi)容或評(píng)價(jià)指標(biāo)的臨床基礎(chǔ)研究出現(xiàn)，為更為科學(xué)、合理地制訂原發(fā)性肝癌的治療策略提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

[1]ShinSW.Thecurrentpracticeoftransarterialchemoembolizationforthetreatmentofhepatocellularcarcinoma[J].KoreanJRadiol,2009,10(5):425-434.

[2]VargaM,ValsanisA,MatiaI,etal.Transarterialchemoembolizationinhepatocellularcarcinoma[J].Rozhl,2009,88(8):434-438.

[3]張躍偉．微創(chuàng)介入治療肝癌對(duì)機(jī)體免疫功能影響的研究現(xiàn)狀與展望[J]．實(shí)用肝臟病雜志，2014，17(3)：231-233,234．

[4]張功霖，趙衛(wèi)．介入治療肝癌對(duì)免疫功能影響的研究進(jìn)展[J]．世界華人消化雜志，2012，20(33)：3225-3230．

[5]MizukoshiE,NakamotoY,AraiK,etal.Comparativeanalysisofvarioustumor-associatedantigen-specifict-cellresponsesinpatientswithhepatocellularcarcinoma[J].Hepatology,2011,53(4):1206-1216.

[6]QiuFB,WuLQ,LuY,etal.PredominantexpressionofTh1-typecytokinesinprimaryhepaticcancerandadjacentlivertissues[J].HepatobiliaryPancreatDisInt,2007,6(1):63-66.

[7]HiroishiK,EguchiJ,BabaT,etal.StrongCD8+T-cellresponsesagainsttumor-associatedantigensprolongtherecurrence-freeintervalaftertumortreatmentinpatientswithhepatocellularcarcinoma[J].JGastroenterol,2010,45(4):451-458.

[8]HiguchiT,KikuchiM,OkazakiM.Hepatocellularcarcinomaaftertranscatheterhepaticarterialembolization[J].Cancer,1994,73(9):2259-2267.

[9]毛華，黃純枳，宋衛(wèi)生，等．雙重介入治療原發(fā)性肝癌患者對(duì)免疫功能的影響[J]．廣東醫(yī)學(xué)，2006，27(3)：341-342．

[10]劉曉芬，宋波，紀(jì)雪紅．介入治療對(duì)原發(fā)性肝癌患者T細(xì)胞亞群比例的影響[J]．放射免疫學(xué)雜志，2010，23(5)：599-600．

[11]韓聚強(qiáng)，范公忍，任永強(qiáng)，等．不同微創(chuàng)介入治療原發(fā)性肝癌對(duì)機(jī)體T細(xì)胞免疫功能的影響[J]．介入放射學(xué)雜志，2014，23(3)：218-221．

[12]曹馳，李青，梁穎，等．原發(fā)性肝癌介入治療后機(jī)體免疫功能的研究[J]．中國(guó)醫(yī)師雜志，2005，7(7)：903-905．

[13]倪全法，王曉光，陳徐艱，等．肝癌患者肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)后細(xì)胞免疫功能的動(dòng)態(tài)變化及其臨床意義[J]．中國(guó)藥物與臨床，2011，11(8)：906-907．

[14]鄒勁林，呂寶軍，楊光偉，等．介入熱灌注化療中晚期肝癌患者免疫功能的影響[J]．中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2009，4(35)：19-20．

[15]CabibboG,LatteriF,AntonucciM,etal.Multimodalapproachestothetreatmentofhepatocellularcarcinoma[J].NatClinPractGastroenterolHepatol,2009,6(3):159-169.

[16]FanWZ,YangJY,LüMD,etal.Transcatheterarterialchemoembolizationpluspercutaneousthermalablationinlargehepatocellularcarcinoma:clinicalobservationofefficacyandpredictorsofprognosticfactors[J].ZhonghuaYiXueZaZhi,2011,91(31):2190-2194.

[17]王忠，馬亦龍．TACE及MWA治療對(duì)肝癌患者免疫功能的影響[J]．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2015，23(14)：2027-2031．

[18]楊茂，郭志，司同國(guó)，等．化療栓塞聯(lián)合冷凍對(duì)肝癌患者免疫功能的影響[J]．放射學(xué)實(shí)踐，2011，26(5)：534-537．

[19]章萬(wàn)勇，查云飛．TACE聯(lián)合部分脾栓塞術(shù)對(duì)肝癌患者免疫功能影響研究[J]．臨床放射學(xué)雜志，2015，34(3)：451-454．

[20]StrebelBM,DufourJF.Combinedapproachtohepatocellularcarcinoma:anewtreatmentconceptfornonresectabledisease[J].ExpertRevAnticancerTher,2008,8(11):1743-1749.

Effect of interventional chemotherapy embolization on cellular immunity function after in patients with primary hepatic cancer*

LiYingchao,MiChen,XueHui,LiWeizhi,LiPeijie,LvLiangshan

(DepartmentofGastroenterology,FirstAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an,Shaanxi710061,China)

Objective To explore the effect of transcatheter arterial chemoembolization (TACE) on the cellular immunity function in the patients with primary hepatic cancer(PHC).Methods Eighty-nine cases of PHC were treated by TACE.The drugs of TACE were adriamycin 40-60 mg,5-Fu 1 000-1 250 mg,oxaliplatin 150-200 mg and leucovorin 300mg respectively.The average dosage of iodinated oil was 10 mL.2 mL of peripheral blood was collected before treatment and at 4 weeks after treatment.The values of T cell subsets (CD3+,CD4+,CD8+and CD4+/CD8+) were determined by using flow cytometry and controlled with those of 30 healthy persons.Results Compared with the healthy control group,the percentages of CD3+,CD4+and the ratio of CD4+/CD8+in the patients with primary hepatic cancer were decreased significantly,which were (33.2±17.5)%,(14.2±7.1)% and 0.87±0.53 respectively.At 4 weeks after TACE treatment,the percentages of CD3+,CD4+were higher than before treatment and the level of CD8+was decreased compared with before treatment (P>0.05),while the ratio of CD4+/CD8+was increased to 1.98±0.72,which was significantly higher than that before treatment(P<0.05).Conclusion The cellular immunity function in the patients with PHC is decreased,and the T cell immunity function will be improved after TACE treatment.

live neoplasms;T cell subsets;cellular immunity function;transcatheter arterial chemoembolization;intervention therapy

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.31.021

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)綜合交叉類科研項(xiàng)目(XJJ2014148)。

厲英超(1974-)，博士，副主任醫(yī)師，主要從事慢性肝病的防治研究。

R

A

1671-8348(2016)31-4382-03

2016-02-18

2016-06-06)