洗滌方式對高通量酶聯免疫吸附試驗檢測系統檢測結核抗體的影響

張淑英，裴景亮，張玉芝，伊正君△

(1.山東省濰坊市第二人民醫院檢驗科 261041；2.濰坊醫學院附屬醫院檢驗科，山東濰坊 261031)

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論著·臨床研究

洗滌方式對高通量酶聯免疫吸附試驗檢測系統檢測結核抗體的影響

張淑英1，裴景亮2，張玉芝2，伊正君2△

(1.山東省濰坊市第二人民醫院檢驗科 261041；2.濰坊醫學院附屬醫院檢驗科，山東濰坊 261031)

目的 評價不同的洗滌參數對高通量酶聯免疫吸附試驗(ELISA)酶免儀檢測結核抗體的影響，通過洗滌液的標準化研究解決ELISA實驗準確性和重復性差的問題。方法 儀器采用煙臺Addcare ELISA500全自動酶免儀，試劑采用商品化的結核抗體檢測試劑，選擇不同體積洗液量，不同洗滌次數，不同振蕩時間及不同的浸泡時間，進行結核抗體的ELISA檢測，觀察對檢測結果的影響。采用SPSS21.0進行統計學分析，分別計算不同的洗滌方式的診斷效能。結果 采用300 μL洗液量，洗滌5次，振蕩30 s，浸泡40 s可以獲得最佳的診斷效能，此時靈敏度為86.67%，特異性為85.71%，陽性預測值為81.25%，陰性預測值為90.00%，陽性似然比率4.33(95%CI:4.11～4.52)，陰性似然比率0.11(95%CI:0.08～0.14)，約登指數為0.72(95%CI:0.68～0.76)。結論 建立的洗滌液系統的標準化程序可以提高檢測方法的靈敏度、特異性和準確性。

高通量分析；酶聯免疫吸附試驗；結核抗體

結核病已成為全球備受關注的重大公共衛生問題，WHO的報告指出，在2012年全球大約有860萬新發結核病例，約130萬人死于結核病[1]。WHO對全球2013年結核分枝桿菌(MTB)的感染發生率進行了評估，我國仍然是高發病率國家。傳統的結核抗體的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測具有操作簡便的特點，但它的結果受實驗過程中多種因素的干擾，普遍存在準確性和重復性差的問題，其靈敏度、特異性也存在爭議[2-3]。本文研究高通量ELISA檢測系統檢測結核抗體試驗過程中洗滌方式對結核抗體檢測結果的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集山東省濰坊市第二人民醫院和濰坊醫學院附屬醫院2013年5月至2014年2月結核科門診及住院的結核病例120例，均符合2001年中華醫學會結核病學分會制定的肺結核診斷標準。168例健康成人(健康體檢人員)作為對照組，兩組之間性別、年齡、卡介苗接種史等差異無統計學意義，所有病例乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)感染指標均為陰性，亦無并發其他急性感染性疾病。

1.2 儀器與試劑 煙臺Addcare ELISA500全自動酶免儀，試劑采用榮盛公司的結核抗體檢測試劑，批號為20130824，實驗前對檢測系統的特異性、敏感性和cut off值的重復性進行了驗證。除研究因素外，其余步驟及操作要素嚴格按照試劑說明書，每次檢測重復3次。

1.3 方法 清晨采集空腹肘靜脈血4 mL，3 000 r/min離心10 min分離血清，血清分裝后-80 ℃保存，備用。選擇100、200、300 μL等不同體積洗液量，4、5、6次不同洗滌次數，10、30、60 s不同清洗震蕩時間，20、30、40、50、60 s不同浸泡時間，進行結核抗體的ELISA檢測，觀察對最終檢測結果(陰、陽性結果)的影響，評價不同因素對靈敏度、特異性、陽性預測值(PPV)、陰性預測值(NPV)、陽性似然比率(PLR)、陰性似然比率(NLR)、約登指數(YI)等的影響。

1.4 統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行數據處理，計數資料以百分率表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同體積洗液量對結核抗體檢測的影響 其余參數選擇：洗滌5次，振蕩30 s，浸泡30 s。結果顯示：洗滌液量為300 μL時方法的靈敏度、PPV、NPV、PLR、NLR、YI等檢驗效能明顯高于其他兩組(P<0.05)，特異性在200 μL和300 μL方法中差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2 不同洗滌次數對結核抗體檢測的影響 其余參數選擇：洗滌液300 μL，振蕩30 s，浸泡30 s。結果顯示：洗滌次數不同時，不同方法間的靈敏度、特異性、PPV、NPV、NLR差異無統計學意義(P>0.05)。洗滌5次時PLR和YI高于洗滌次數為4次的方法(P<0.05)；與洗滌次數為6次比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

2.3 不同振蕩時間對結核抗體檢測的影響 其余參數選擇：洗滌液300 μL，洗滌5次，浸泡30 s。結果顯示：振蕩30 s的方法在靈敏度、特異性、PPV、NPV、PLR、NLR、YI方面的診斷效能高于振蕩10 s的方法(P<0.05)；在靈敏度、特異性、NPV、NLR、YI方面的診斷效能與振蕩60 s的方法比較差異無統計學意義(P>0.05)，在PPV和PLR的診斷效能方面高于振蕩60 s的方法(P<0.05)，見表3。

2.4 不同浸泡時間對結核抗體檢測的影響 其余參數選擇：洗滌液300 μL，洗滌5次，振蕩時間30 s。結果顯示：浸泡40 s的方法在靈敏度、NPV、PLR、NLR、YI方面的診斷效能高于浸泡時間(P<0.05)；在特異性方面浸泡30 s和40 s差異無統計學意義(P>0.05)，均高于其他浸泡時間(P<0.05)；在PPV診斷效能方面浸泡60 s時診斷效能最高，浸泡40 s和50 s差異無統計學意義(P>0.05)，均高于其他浸泡20 s和30 s(P<0.05)，見表4、圖1。

圖1 不同浸泡時間對YI指數的影響

洗滌液(μL)靈敏度(%)特異性(%)PPV(%)NPV(%)PLR(95%CI)NLR(95%CI)YI(95%CI)10054.17*72.62*58.56*68.93*1.41(1.21～1.67)*0.45(0.32～0.55)*0.27(0.24～0.30)*20077.50*82.7476.23*83.73*3.21(2.99～3.47)*0.19(0.16～0.21)*0.61(0.57～0.64)*30081.6783.9378.4086.503.63(3.15～3.95)0.16(0.11～0.20)0.66(0.58～0.73)

*:P<0.05，與300 μL洗液的診斷效能比較。

表2 不同洗滌次數對檢驗效能的影響

*：P<0.05，與洗滌效數5次的診斷效能比較。

表3 不同振蕩時間對結核抗體檢測的影響

*:P<0.05，與振蕩30 s的診斷效能比較。

表4 不同浸泡時間對結核抗體檢測的影響

*：P<0.05，與浸泡40 s的診斷效能比較。

3 討 論

目前，結核病控制面臨的挑戰是多方面的，包括：艾滋病與結核病的雙重感染，缺乏有效的疫苗，不斷出現的耐多藥結核分枝桿菌，結核病的藥物治療比目前已知的其他細菌的治療療程更長、更復雜[4]，其在機體內的代謝機制也尚未明確[5]；其中最重要的一點是沒有特異性的生物標志物，無法早期特異性地診斷結核病?，F有的診斷方法普遍存在特異性和靈敏度不高的特點[6-7]，尋找一種快速、準確、低廉的診斷方法對于結核病的早期診斷、早期干預及防止耐藥菌的產生和傳播具有重要的意義。有研究證實：結核分枝桿菌的特異性分泌蛋白的抗體檢測對結核病的診斷具有重要意義，利用基因工程技術將結核分枝桿菌的多種分泌蛋白制成融合蛋白，利用ELISA技術檢測血清中對應的抗體可用于不同類型結核病的診斷[8]。

ELISA是臨床實驗室最基本、最常用的實驗方法之一，洗板是ELISA實驗的關鍵步驟，洗板的目的是清除非特異性的干擾物質，洗板效果決定著整個實驗的成敗，有研究表明人為改變洗板因素會影響檢測結果的特異性和靈敏度[9]。國內研究顯示洗板不徹底會出現非特異性顯色，導致結果出現假陽性；過度洗板會使得低值陽性標本出現假陰性[10]。洗滌因素對結核抗體ELISA檢測結果的影響在國內尚無系統的研究和報道，為了明確這些因素對檢測結果的影響，筆者對高通量ELISA檢測系統的洗滌液及洗滌方式進行標準化研究以解決結核抗體ELISA試驗中準確性和重復性差的問題。

本研究中筆者采用上海榮盛公司的結核抗體檢測試劑，試劑盒將7種特異抗原優勢肽段分別制備成多表位融合抗原，用以檢測患者外周血的結核抗體。300 μL洗液，震蕩30 s，洗板4次，浸泡30 s為試劑盒說明書中給出的洗板參數。筆者以此為對照，依次對洗滌液體積、洗板次數、振蕩時間、浸泡4個影響因素進行了評價。結果顯示按照說明書規定浸泡30 s的300 μL洗液，震蕩30 s，洗板5次時診斷效能最高；在評價浸泡時間因素的影響時，筆者發現此因素較復雜，對結果的靈敏度、特異性影響較大。因此本研究中使用了更多的時間參數，并以YI作為評價標準；結果顯示浸泡40 s時，YI最高，與其他浸泡時間相比差異有統計學意義(P<0.05)。為篩選浸泡40 s時洗滌液體積、洗板次數、振蕩時間的最佳參數，筆者重新對這3個因素進行了評價，結果分別為300 μL、5次、30 s，與浸泡30 s時參數相同(數據未展示)。

最終研究結果顯示：不同的洗滌液體積、洗板次數、振蕩時間、浸泡時間對檢驗診斷效能都有影響，與李金龍等[11]的研究結果一致。本檢測系統洗板的最佳參數為洗液300 μL，震蕩時間30 s，浸泡時間40 s，洗板5次，此時靈敏度為86.67%，特異性為85.71%，PPV為81.25%，NPV為90.00%，PLR為4.33(95%CI:4.11～4.52)，NLR為0.11(95%CI:0.08～0.14)，YI為0.72(95%CI:0.68～0.76)。在所有的洗滌參數組合中，筆者建立的體系約登指數最高，與其他組合相比，差異有統計學意義(P<0.05)。本研究結果同時顯示高通量的ELISA的自動化檢測能夠提高檢測結果的重復性，特別是cut off值，與相關報道一致[12]。

標準化、自動化是醫學實驗室的發展趨勢，高通量ELISA分析系統洗滌程序的標準化可以排除潛在的影響因素，提高實驗的靈敏度、特異性和準確性。基因工程技術制成的致病結核分枝桿菌的融合抗原試劑與自動化、標準化的酶免疫聯合應用是一種簡便、快捷、準確性高的實驗方法[13]，可以為結核病的臨床診斷與防治提供科學的依據。

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Impact of washing mode on detecting tuberculosis antibody by high-throughput ELISA detection system*

ZhangShuying1，PeiJingliang2，ZhangYuzhi2，YiZhengjun2△

(1.DepartmentofClinicalLaboratoryWeifangMunicipalSecondPeople′sHospital,Weifang,Shandong261041,China;2.DepartmentofClinicalLaboratoryAffiliatedHospitalofWeifangMedicalCollege,Weifang,Shandong261031,China)

Objective To evaluate the impact of different washing parameters on detecting tuberculosis(TB) antibody by high-throughput ELISA detection system,and to solve the poor accuracy and poor repeatability problem of ELISA through the standardization of cleaning solution.Methods The Addcare ELISA500 automatic enzyme immunoassay instrument was adopted.The reagent adopted the commercial TB antibody reagent kit.The ELISA detection was performed by selecting different volumes of washing solution,different washing time,different oscillation time and different soaking time.The impact on the detection results was observed.The software SPSS21.0 was used for conducting statistical analysis.The diagnostic efficiencies of different washing modes were respectively calculated.Results The best diagnostic efficiency was obtained by 300 μL of washing solution,washing for 5 times,oscillating for 30 s and soaking for 40 s,the sensitivity,specificity,positive predictive value,negative predictive value,positive likelihood ratio,negative likelihood ratio and Youden index were 86.67%,85.71%,81.25%,90.00%,4.33 (95%CI:4.11-4.52),0.11(95%CI:0.08-0.14) and 0.72 (95%CI:0.68-0.76) respectively.Conclusion The established standardization procedure of washing solution system can increase the sensitivity,specificity and accuracy of detection method.

high-throughput screening assays;enzyme-linked immunosorbent assay;antibodies,tuberculosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.31.015

衛生部醫藥衛生科技發展研究中心專項課題(28-10-5)。

張淑英(1979-)，碩士，主管技師，主要從事結核病的臨床診斷。△

，E-mail:13505360413@163.com。

R446

A

1671-8348(2016)31-4366-03

2016-03-07

2016-06-21)