OPG/RANKL/RANK調節系統與大鼠慢性牙周炎發展的相關性分析

鄒林洪，胡 丹，張琳林△，彭 春，戴紅衛

(1.重慶醫科大學附屬永川醫院口腔科，重慶 402160； 2.重慶醫科大學附屬口腔醫院正畸科，重慶 400015)

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論著·基礎研究

OPG/RANKL/RANK調節系統與大鼠慢性牙周炎發展的相關性分析

鄒林洪1，胡 丹1，張琳林1△，彭 春1，戴紅衛2

(1.重慶醫科大學附屬永川醫院口腔科，重慶 402160； 2.重慶醫科大學附屬口腔醫院正畸科，重慶 400015)

目的 研究骨保護素(OPG)/細胞核因子κB受體活化因子配體(RANKL)/細胞核因子κB受體活化因子(RANK)調節系統與大鼠慢性牙周炎之間的關系。方法 選取48只雄性SD大鼠，采用結扎絲方法建立大鼠慢性牙周炎模型進行研究，對比觀察OPG、RANKL的免疫組化檢測結果以及破骨細胞計數結果。結果 在第56天時破骨細胞數量達到峰值，實驗組從第7天開始RANKL蛋白平均光密度值高于對照組(P<0.05)；從第14天開始實驗組細胞表面OPG的平均光密度值低于對照組(P<0.05)，實驗組RANKL/OPG比值也發生了明顯改變。結論 OPG、RANKL和RANK參與了大鼠慢性牙周炎的牙槽骨吸收活動，RANKL與OPG比例的失調在慢性牙周炎的發生發展中起著重要的作用。

牙周炎；骨保護素；細胞核因子κB受體活化因子配體；細胞核因子κB受體活化因子

牙周病是口腔中一種極為常見的疾病，該疾病在我國人群中的發病率高達70.0%[1]。慢性牙周炎也是導致患者牙齒松動和缺失的最主要原因，對患者的咀嚼功能產生不利影響，對患者的生活質量以及生命健康造成了嚴重的威脅。因此，慢性牙周炎是目前牙周病研究的熱點。有研究指出，OPG/RANKL/RANK調節系統與牙周炎的發病有著密切的關系[2-3]。為了進一步探討研究骨保護素(OPG)/細胞核因子κB受體活化因子配體(RANKL)/細胞核因子κB受體活化因子(RANK)調節系統與慢性牙周炎之間的關系，本研究建立了大鼠慢性牙周炎模型進行研究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取48只7周齡雄性SD大鼠(購自重慶醫科大學動物實驗中心)，體質量為(150±10)g，將大鼠平均分為8組，每組6只，進行自身對照。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠慢性牙周炎模型 采用結扎絲方法建立大鼠慢性牙周炎模型，具體過程如下：在大鼠左側上頜第一磨牙的齦緣下用0.25 mm正畸絲結扎作為實驗組，右側不作處理作為對照組；分別在建立模型的第7、14、21、28、35、42、49、56天以10%水合氯醛按照3 mL/kg的比例對大鼠進行麻醉，以4%多聚甲醛灌注內固定，取雙側第一磨牙及其周圍牙槽骨組織，隨后常規制作組織切片。

1.2.2 HE染色 (1)10.0%乙二胺四乙酸(EDTA)將雙側標本4 ℃脫鈣45～60 d，以針剌無阻力感為完成脫鈣標準，隨后進行脫水、石蠟包埋；(2)平行于牙體長軸將標本以5 mm厚度做頰、舌向切片，出現第一磨牙頰側牙根時開始收集組織切片；(3)每個標本選取1張切片，進行常規脫蠟水化操作，常規染色，顯微鏡下觀察牙周組織情況。

1.2.3 TRAP染色破骨細胞計數 每個標本選取3張切片隨后按照抗酒石酸酸性磷酸酶檢測試劑盒具體步驟進行操作。在顯微鏡下計數牙根周圍牙槽骨表面的陽性染色破骨細胞個數，重復3次取平均值。

1.2.4 OPG、RANKL免疫組化檢測 采用SABC免疫組織化學試劑盒進行免疫組織化學染色，將石蠟切片進行脫蠟水化，經內源性過氧化酶阻斷，利用5%的牛血清清蛋白BSA進行封閉，隨后分別加入稀釋的一抗，進行2 h的溫室孵育后加入二抗以及DAB顯色液進行顯色；使用蘇木精進行復染，并常規脫水，封片后觀察。陽性強度用平均光密度值表示。染色條件一致，拍照曝光由一個人完成，每個標本選用一張切片，在400倍高倍鏡下隨機選取5個不重疊視野，求平均值作為陽性細胞平均光密度值。平均光密度值=累積光密度/ 測量面積。

1.3 觀察指標 對比觀察破骨細胞計數結果以及OPG、RANKL、RANK的表達結果，計算RANKL/OPG比值。

2 結 果

2.1 動物模型以及HE染色結果 肉眼見28～56d時大鼠左側上頜第一磨牙牙齦紅腫，軟垢和牙結石堆積，探診極易出血，探及牙周袋深。 組織學觀察牙齦組織有大量炎癥細胞浸潤，牙周膠原纖維排列紊亂，暴露的牙根表面和牙槽骨上有大量吸收陷窩，隨著時間延長，各種表現程度越重，表明慢性牙周炎模型建立成功。對照組未見明顯的牙齦紅腫，探診不易出血，HE染色未見明顯的炎癥細胞，膠原纖維排列規則。

2.2 破骨細胞計數 陽性細胞標準：細胞核大于2個，胞質呈酒紅色，形狀不規則。對照組偶見顏色較淺的陽性細胞。實驗組各時間點可見深染TRAP陽性染色破骨細胞，分布在牙槽骨中。通過對比觀察，實驗組破骨細胞數量和對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。隨后隨著時間延長破骨細胞數量開始升高，在第56天時破骨細胞數量達到峰值，見圖1、表1。

表1 慢性牙周炎模型破骨細胞計數對比，個)

a:P<0.05,與對照組比較。

2.3 免疫組化檢測 通過對比觀察可以發現：對照組大鼠牙周組織具有適量的RANKL蛋白淡黃色顆粒表達，但在實驗組中炎癥明顯的區域RANKL蛋白褐色顆粒的表達量明顯增加；對照組大鼠牙槽骨中具有適量的OPG棕黃色顆粒彌漫性弱陽性表達，在實驗組中慢性牙周炎明顯的區域，OPG淡黃色顆粒的表達相對較少。實驗組從第7天開始RANKL蛋白平均光密度值高于對照組(P<0.05)；從第14天開始實驗組細胞表面OPG的平均光密度值低于對照組(P<0.05)，實驗組RANKL/OPG比值第7天時開始升高，到第56天達到峰值，對照組RANKL/OPG比值一直比較平穩，未見明顯升高或降低，見表2。

表2 OPG、RANKL免疫組化染色平均光密度值

a:P<0.05,與對照組比較。

A：實驗組第7天;B:實驗組第56天。

圖1 破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶染色(×200)

3 討 論

OPG是一種可溶性分泌蛋白，主要由成骨細胞分泌。OPG主要的生物學行為是作用于破骨細胞的分化末期，抑制破骨細胞生成，誘導破骨細胞凋亡，并阻斷破骨細胞的病理性增生、活化[4]。RANKL是破骨細胞分化因子，是一種骨保護素配體，能刺激破骨細胞分化，促進破骨細胞骨吸收，能夠通過和破骨前體細胞膜上的RANK結合來促進破骨細胞分化抑制其凋亡[5]。RANK是一種縮氨酸，由成骨細胞及活性T細胞分泌產生，目前被認為是已知的RANKL惟一的受體，主要與RANKL的C 端結合產生信號，進而啟動信號轉導途徑[6]。OPG可以與RANKL競爭結合RANK，從而阻斷RANKL和RANK的結合，抑制破骨細胞的成熟和分化，導致破骨細胞數量減少，達到減少骨吸收，增加骨量的作用[7]。

OPG、RANKL、RANK調節系統能調節破骨細胞的生物學效應和骨的動態平衡，是各種通路誘導破骨細胞的分化成熟最終因子[8]。成骨細胞受到刺激之后膜表面表達的RANKL，能夠識別破骨細胞前體細胞并和其膜上的RANK結合，刺激其分化成熟并產生破骨細胞，起到骨吸收的作用[9]。此外，成骨細胞也可以通過OPG的表達來抑制RANKL和RANK的作用機制[10]。OPG還可以和RANKL-RANK結合體再次結合來形成三聚體，起到直接抑制RANKL-RANK的作用[11]。有研究表明，去除小鼠的OPG 基因會引起破骨細胞數量增多導致嚴重的骨質疏松[12]。對去除RANK基因片段的小鼠進行研究后發現，小鼠會出現由于缺乏破骨細胞而形成骨質硬化。

近年來有專家認為RANKL/RANK/OPG 系統可能是聯系骨代謝與免疫系統之間的橋梁，由免疫系統炎性反應導致的骨吸收[13]。有研究表明激活的T淋巴細胞導致了牙周炎癥組織中RANKL的mRNA高表達，同時OPG的mRNA水平相應下降[14]。因而可以通過選擇性的調節機體的免疫反應來對OPG/RANKL進行調控，進而對牙槽骨的局部微環境進行調控。本研究發現，與對照組比較，實驗組大鼠慢性牙周炎活動明顯的每個觀察點，RANKL在成骨細胞及其基質細胞表達更明顯，與對照組相比其水平明顯增加；而OPG水平在成骨細胞及其基質細胞的表達水平有所減少，與對照組相比其水平明顯減少。所以，OPG/RANKL/RANK調節系統確實在慢性牙周炎活動中發揮了極為重要的作用。

OPG以及RANKL在牙槽骨中的表達受到多種因素的調節和影響，本研究發現RANKL的水平升高，OPG的水平降低，RANKL/OPG比值在實驗組比對照組大，實驗組RANKL/OPG比值從第7天開始一直持續升高，到第56天達到峰值，而對照組RANKL/ OPG比值一直比較平穩，未見明顯升高或降低。因此可以推斷RANKL和OPG及二者比值的變化反映了牙周吸收情況，OPG和RANKL過多或過少對骨代謝均產生不利影響，需要RANKL與OPG維持一定的比例才能達到牙周骨代謝的平衡。牙周局部微環境RANKL/OPG 比例的失調導致了實驗組破骨活動活躍，牙槽骨組織發生了過量吸收，因此可以得知，在對照組中，RANKL、OPG 之間比例正常，對照組牙周組織未發生明顯的吸收和增長，處于平衡狀態。RANKL/OPG比值的改變在慢性牙周炎的發展中起著重要的作用；RANKL/OPG比值與調節破骨細胞分化成熟密切相關，在牙周組織破壞的發生、發展過程發揮了重要的作用，最終影響牙槽骨的骨密度和骨強度。RANKL/OPG 比值可以作為衡量慢性牙周炎牙槽骨吸收嚴重程度的客觀指標之一，牙槽骨的吸收嚴重程度與牙周局部RANKL、OPG比例失調呈正相關。

綜上所述， OPG、RANKL和RANK調節系統參與了大鼠慢性牙周炎牙槽骨的吸收活動，RANKL和OPG是慢性牙周炎的重要調節因子，其中RANKL/OPG比例的失調在慢性牙周炎中起著重要的作用。通過改變牙周炎患者牙周組織中的OPG、RANKL含量，使OPG含量表達增加，減少RANKL含量，改善牙周局部RANKL 與OPG 之間的比例來達到抑制骨吸收、促進新骨生成的作用，使預防慢性牙周炎牙槽骨吸收的發生成為可能。

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Analysis on correlation between OPG/RANKL/RANK regulation system and chronic periodontitis progress*

ZouLinhong1,HuDan1,ZhangLinlin1△,PengChun1,DaiHongwei2

(1.DepartmentofStomatology,AffiliatedYongchuanHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing402160,China;2.DepartmentofOrthodontics,AffiliatedStomatologyHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400015,China)

Objective To investigate the relationship between OPG/RANKL/RANK regulation system and periodontitis.Methods Forty-eight male SD rats were selected to establish the rat periodontitis model by adopting the ligature wire method.The detection results of OPG and RANKL by the immunohistochemical method and and the results of osteoclasts count were comparatively observed.Results The number of osteoclasts on 56 d reached the peak value.The average optical density value of RANKL protein from 7 d in the experimental group was higher than that in the control group(P<0.05);the average optical density value of cellular surface OPG from 14 d in the experimental group was lower than that in the control group(P<0.05);the RANKL/OPG ratio in the experimental group also had significant change.Conclusion OPG,RANKL and RANK are involved in the absorption activity of alveolar bone in rat chronic periodontitis.The imbalance of RANKL and OPG ratio plays an important role in the development of chronic periodontitis.

periodontitis;osteoprotegerin;RANKL;RANK

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.31.005

重慶醫科大學附屬永川醫院課題(YJQN20120025)。

鄒林洪(1982-)，碩士，主治醫師，主要從事口腔醫學相關研究?！?/p>

，E-mail:zhanglinlin71@163.com。

R781.4+2

A

1671-8348(2016)31-4334-03

2016-02-21

2016-06-09)