達比加群對凝血酶誘導的人氣道平滑肌細胞收縮和增殖的影響

姚智慧，程遠雄△，賴文巖，蔡開燦

(南方醫科大學南方醫院：1.呼吸科；2.心血管內科；3.心胸外科，廣州 510515)

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·論 著·

達比加群對凝血酶誘導的人氣道平滑肌細胞收縮和增殖的影響

姚智慧1，程遠雄1△，賴文巖2，蔡開燦3

(南方醫科大學南方醫院：1.呼吸科；2.心血管內科；3.心胸外科，廣州 510515)

目的 探討達比加群對凝血酶誘導的人氣道平滑肌(HASM)細胞收縮和增殖的影響。方法 將原代培養的HASM細胞用于實驗。用免疫熒光的方法觀察細胞收縮的形態學變化；用Western blot法分析α-actin蛋白相對表達量；用cck8法檢測平滑肌細胞增殖能力。結果 達比加群能顯著抑制凝血酶誘導的HASM細胞骨架重組和收縮蛋白α-actin的表達(P<0.05)。對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、轉化生長因子-β1、血小板源性生長因子、乙酰甲膽堿、凝血酶的促增殖能力進行比較，凝血酶顯著強于AngⅡ,僅次于10%胎牛血清(P<0.05)。達比加群呈濃度依賴性和時間依賴性地抑制了凝血酶誘導的HASM細胞增殖(P<0.05)。結論 達比加群能夠顯著抑制凝血酶誘導的HASM細胞收縮和增殖。

平滑肌細胞;凝血酶;達比加群;血管緊張素Ⅱ;轉化生長因子-β

氣道高反應性和氣道重塑是哮喘的兩大病理特征，是導致哮喘患者氣道狹窄、氣流受限、肺功能持續下降的主要原因。氣道平滑肌細胞作為氣道的主要收縮細胞，是氣道高反應性最終效應的執行者。同時，其增殖不僅使氣道平滑肌層收縮能力增強，而且通過參與氣道重塑進一步加劇哮喘患者氣流受限。因此，徹底控制氣道平滑肌細胞收縮和增殖對哮喘患者尤其是難治性哮喘患者的治療及改善預后有重要意義。多項研究顯示，在哮喘炎癥狀態下，哮喘氣道凝血系統過度激活，凝血酶活性顯著高于健康對照組[1-2]。過度激活的凝血酶可誘導人氣道平滑肌(HASM)細胞、肺成纖維細胞收縮和增殖[3]。然而，凝血酶在肺成纖維細胞的這一作用在體內外試驗中都已證實可被新型高效的直接凝血酶抑制劑-達比加群所抑制[4-5]。本試驗以HASM細胞為試驗對象，探討達比加群對凝血酶誘導的HASM細胞收縮和增殖的影響，以期為達比加群可能成為治療哮喘氣道高反應性和氣道重塑藥物提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清、高糖DMEM培養基、胰蛋白酶購于美國Gibco公司;人凝血酶、羅丹明鬼筆環肽購于美國Sigma公司，達比加群購于德國Boehringer Ingelheim Pharma公司；cck8試劑購于日本同仁公司；小鼠抗平滑肌α肌動蛋白(α-SMA)，BCA100蛋白定量分析試劑盒和全蛋白提取試劑盒購于碧云天生物技術研究所；小鼠抗GAPDH抗體購于北京博奧森生物技術有限公司；FITC-山羊抗小鼠二抗購于北京中杉金橋生物科技有限公司；小鼠IgG-HRP二抗購于杭州弗德生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原代人氣道平滑肌細胞的培養 本試驗獲南方醫科大學南方醫院倫理委員會批準(NFEC-201109-K1)。試驗前均已告知患者試驗目的并簽署知情同意書。取南方醫院胸外科肺葉切除手術標本，采用組織塊貼壁法培養原代HASM細胞。細胞從組織塊爬出、融合后，用0.125%胰酶消化，部分變圓時以10%FBS立即終止。以后按1∶2常規傳代，取3～6代對數生長期細胞用于試驗研究。

1.2.2 免疫熒光 將細胞以30%～40%的密度均勻種于處理過的玻片上，待細胞長至50%～60%融合時分為對照組、凝血酶組、凝血酶+達比加群組刺激30 min。PBS液輕柔漂洗2遍后，用3.75%多聚甲醛固定30 min，TritonX-100通透5 min，5%BSA室溫封閉1 h。然后用α-SMA抗體4 ℃孵育過夜或羅丹明鬼筆環肽室溫孵育45 min。PBS漂洗3遍后室溫孵育熒光二抗30 min或予以DAPI室溫復染5 min,封片后在正置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 Western blot檢測α-actin蛋白的表達 常規接種6 cm平皿，細胞饑餓過夜后，分對照組、凝血酶組、凝血酶+達比加群組。細胞經預冷的PBS液沖洗2次，加入80 μL蛋白裂解液冰上裂解，收集細胞。轉移至EP管，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，收集上清液，用BCA法測定蛋白濃度。10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后濕轉至PVDF膜，5%BSA室溫封閉1 h，α-actin一抗4 ℃孵育過夜；次日二抗室溫孵育2 h。采用ECL化學發光法曝光顯示目的條帶。用Gel-Pro analyzer圖像分析軟件分析條帶灰度值，以α-actin/GAPDH代表目的蛋白的相對表達量。

1.2.4 cck8細胞增殖實驗 常規消化細胞后計數，以8×103個/孔的密度將200 μL細胞懸液種于96孔培養板，37 ℃孵育過夜。細胞刺激預先設計的濃度和時間后，按每孔10 μL加入cck8溶液，37 ℃避光孵育2 h,用酶標儀檢測吸光度值A450。

1.3 統計學處理 應用Graphpad Prism 6軟件統計數據，多組間經方差分析具有統計學差異后，選用Bonferroni′s多重檢驗進行組間比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 原代HASM細胞培養與鑒定 采用組織塊貼壁法分離培養HASM細胞。約2周后原代細胞從貼壁組織邊緣長出，并以組織塊為中心向周邊延伸直至融合。見圖1。

A：原代HASM細胞從組織爬出后逐漸融合呈現“峰谷征”；B： 免疫熒光染色可見α-SMA為綠色熒光，DAPI染核呈藍色熒光。

圖1 原代HASM細胞形態及表型鑒定(×100)

A：對照組；B：凝血酶組；C：凝血酶+達比加群組。

圖2 達比加群對凝血酶誘導的HASM細胞骨架重組的抑制(×1 000)

2.2 達比加群對凝血酶促HASM細胞收縮效應的影響 以羅丹明鬼筆環肽標記細胞骨架，從形態學上觀察細胞收縮變化。如圖2所示，凝血酶(1 U/mL)刺激HASM細胞30 min后，細胞骨架重組，細胞張力明顯增加，并可見濃密的F-actin應力纖維。達比加群與凝血酶共培養后，張力減弱，F-actin應力纖維稀疏。為了進一步證明達比加群能夠抑制凝血酶誘導的HASM細胞收縮，筆者用Western blot檢測α-actin蛋白的表達。如圖3所示，凝血酶誘導的α-actin表達被達比加群顯著抑制(P<0.05)。

A:對照組；B：達比加群組；C：凝血酶組；D：凝血酶+達比加群組。

圖3 達比加群對凝血酶誘導的HASMα-actin蛋白表達的抑制

2.3 多種促生長介質對HASM細胞增殖能力的比較 多年來，本課題組專注于血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)、血小板源性生長因子(PDGF)、乙酰甲膽堿(Mch)、凝血酶促HASM重塑機制的研究[6]，但未對其促增殖能力進行比較。如圖4所示，與對照組相比，凝血酶促增殖能力最強，僅次于10%FBS；PDGF(20 ng/mL)、TGF-β1(2 ng/mL)、AngⅡ (10-7mol/L)同樣能促進HASM細胞生長(P<0.05)，而Mch無促增殖作用(P>0.05)。凝血酶與PDGF、TGF-β1、AngⅡ相比，只有凝血酶與AngⅡ的促增殖能力比較差異有統計學意義(P<0.05)。

*：P<0.05,**：P<0.01,***：P<0.001，與對照組比較。

圖4 多種促增殖介質對HASM細胞促增殖能力的對比

2.4 達比加群對凝血酶促HASM細胞增殖效應的影響 選取100～5 000 ng/mL達比加群與凝血酶(1 U/mL)共同刺激HASM細胞48 h。如圖5所示，1 000、3 000、5 000 ng/mL達比加群可顯著抑制凝血酶誘導的HASM細胞增殖，5 000 ng/mL作用最強(P<0.05)。然而經統計學分析，單用5 000 ng/mL達比加群已經對HASM細胞有毒副作用。因此，本研究選取3 000 ng/mL達比加群進行后續試驗。

為了進一步檢測達比加群是否可持續性抑制凝血酶誘導的HASM細胞增殖，本研究將達比加群(3 000 ng/mL)與凝血酶共同刺激HASM 細胞12～72 h后檢測各培養孔吸光度值。如圖6所示，從24 h開始，達比加群呈時間依賴性地抑制了凝血酶誘導的HASM細胞增殖(P<0.05)。

*：P<0.01,**：P<0.001，與凝血酶組比較。

圖5 達比加群濃度依賴性地抑制凝血酶誘導的HASM細胞增殖

*：P<0.05,**：P<0.01，與單用凝血酶相比。

圖6 達比加群時間依賴性地抑制凝血酶誘導的HASM細胞增殖

3 討 論

近年來，肺內凝血已成為哮喘防治的研究熱點。多家權威雜志新近報道，凝血不僅發生在受損血管，還發生在哮喘炎性氣道[7-8]。研究發現哮喘患者處于血栓前狀態。與健康對照組相比，哮喘患者血管性血友病因子抗原(vWF)，血漿D二聚體和纖溶酶原激活物抑制劑-1顯著升高[9]；凝血功能主要包括活化部分凝血活酶時間、血漿凝血酶時間、血漿凝血酶原時間縮短和纖維蛋白原顯著升高[10]。在哮喘炎癥狀態下，肺內毛細血管網通透性增加，凝血因子、組織因子大量涌入肺泡間隔，從而啟動內、外源性凝血途徑，導致肺臟局部處于高凝狀態，凝血酶過度產生[8]。據文獻報道，哮喘急性發作或穩定期哮喘患者局部肺組織予以過敏原激發后，凝血酶活性顯著高于健康對照組[11]。過度激活的凝血酶通過刺激氣道平滑肌細胞和成纖維細胞收縮、增殖，誘導多種細胞因子、生長因子產生而廣泛參與哮喘氣道高反應性、氣道重塑過程。因此，凝血酶已成為哮喘患者降低氣道高反應性，延緩氣道重塑的重要靶點。

已有研究報道凝血酶及凝血酶受體激活肽可誘導豚鼠氣道及離體支氣管環收縮[12]。本研究從細胞水平證實凝血酶可刺激HASM細胞骨架重組和收縮蛋白α-actin表達。并且本研究進一步證明新型高效的直接凝血酶抑制劑達比加群可阻斷凝血酶的這一作用(圖2、3)。這與達比加群在肺成纖維細胞可抑制凝血酶誘導的膠原凝膠收縮和細胞骨架重組的結果一致[4]。

AngⅡ、TGF-β1、PDGF、凝血酶都是良好的HASM細胞有絲分裂原。已有研究發現，凝血酶可通過誘導MAPK磷酸化刺激HASM細胞增殖[13]。本研究對多種促生長介質的增殖能力進行了對比，結果顯示凝血酶的促增殖能力顯著強于AngⅡ，僅次于陽性對照10%FBS(圖4)。這可能與凝血酶和AngⅡ各自受體在HASM細胞的表達水平及靶器官不同有關。

本研究通過達比加群濃度梯度和時間進程相關試驗證明，達比加群可呈濃度與時間相關性抑制凝血酶誘導的HASM細胞增殖(圖5、6)。這與達比加群可阻斷凝血酶誘導的人肺成纖維細胞增殖的結果是一致的。但是本試驗中選取的達比加群最佳濃度3 000 ng/mL明顯高于其在人肺成纖維細胞的濃度1 000 ng/mL。雖然本試驗中1 000 ng/mL達比加群也能抑制凝血酶的作用，這可能是由于HASM細胞和肺成纖維細胞對達比加群的敏感性以及對達比加群溶解劑二甲基亞砜(DMSO)的耐受程度不同。DMSO作為助溶劑刺激細胞超過一定濃度時會對細胞的生長產生抑制作用；國內外文獻報道的濃度范圍因細胞種類不同而異，公認標準為DMSO濃度在0.1%以下時對細胞的生長無影響。在本試驗中，5 000 ng/mL達比加群組的DMSO濃度為0.5%，已經對HASM細胞的生長產生了抑制作用。另外，凝血酶的生物學效應主要通過水解凝血酶受體PAR1介導。已有研究證實，達比加群能夠通過阻斷凝血酶催化水解PAR1，減少下游信號通路ERK1/2和AKT的磷酸化，并降低臍靜脈和腦內皮細胞的通透性[14]。達比加群在HASM細胞對凝血酶誘導的收縮和增殖的抑制作用是否也與PAR1相關以及下游信號通路變化如何，將是本課題組后續研究的方向。

目前，糖皮質激素是治療哮喘的主要藥物，但這只能控制哮喘氣道炎癥卻不能充分抑制氣道平滑肌細胞增殖等導致的氣道重塑。另外，在臨床試驗中，對哮喘患者予以肝素為代表的抗凝治療只能緩解哮喘患者主觀癥狀，而肺功能無明顯改善[15]。究其原因可能與肝素不能特異阻斷凝血級聯反應及凝血酶有關。達比加群是繼華法林之后50年來上市的首個新型口服抗凝血藥物，已被美國等多個西方國家權威指南推薦替代華法林用于心房顫動的抗凝治療，其適應證還在不斷拓寬。與維生素K拮抗劑華法林相比，達比加群不僅能特異阻斷凝血酶，還具有起效快，可預見的藥代動力學和藥效學參數，無需定期監測凝血功能，不易與食物及其他藥物發生相互作用等優勢[16]。研究顯示，在屋塵螨誘導的哮喘小鼠模型中，達比加群能夠抑制Th2型細胞因子白細胞介素-4水平。而本研究結果證明，達比加群可顯著抑制哮喘關鍵因子凝血酶誘導的HASM細胞收縮和增殖。因此，達比加群依賴其抗凝特異性及藥理學優勢可能成為新的哮喘抗凝治療藥物。

總之，凝血酶誘導的HASM細胞收縮和增殖能被達比加群所抑制。本研究結果為達比加群成為治療哮喘氣道高反應性和氣道重塑藥物提供了細胞學證據。

[1]Brims FJH,Chauhan AJ,Higgins B,et al.Coagulation factors in the airways in moderate and severe asthma and the effect of inhaled steroids[J].Thorax,2009,64(12):1037-1043.

[2]SchoutenM,LeviM.Earlyactivationofcoagulation after allergen challenge in patients with allergic asthma[J].J Throm Haemostasis,2009,7(9):1592-1594.

[3]Chambers RC.Procoagulant signalling mechanisms in lung inflammation and fibrosis:novel opportunities for pharmacological intervention?[J].Br J Pharmacol,2008,153 Suppl 1:S367-S378.

[4]Bogatkevich GS,Ludwicka-Bradley A,Silver RM.Dabigatran,a direct thrombin inhibitor,demonstrates antifibrotic effects on lung fibroblasts[J].Arth Rheum,2009,60(11):3455-3464.

[5]Bogatkevich GS,Ludwicka-Bradley A,Nietert PJ,et al.Antiinflammatory and antifibrotic effects of the oral direct thrombin inhibitor dabigatran etexilate in a murine model of interstitial lung disease[J].Arth Rheum,2011,63(5):1416-1425.

[6]霍雅婷，程遠雄，賴文巖，等.Wnt/β-連環蛋白信號通路在誘導氣道平滑肌細胞外基質蛋白沉積中的作用[J].重慶醫學,2015,44(35):4897-4899.

[7]Phimister EG,Lambrecht BN,Hammad H.Asthma and Coagulation[J].New Engl J Med,2013,369(20):1964-1966.

[8]de Boer JD,Majoor CJ,van T Veer C,et al.Asthma and coagulation[J].Blood,2012,119(14):3236-3244.

[9]Sneeboer MM,Majoor CJ,de Kievit A,et al.Prothrombotic state in patients with severe and prednisolone-dependent asthma[J].J Allergy Clin Immunol,2015,137(6):1727-1732.

[10]趙丹,哈依努爾，克麗別娜·吐爾遜.支氣管哮喘患者凝血功能狀態的臨床分析[J].臨床肺科雜志,2013，18(9):1701-1702.

[11]Terada M,Kelly EA,Jarjour NN.Increased thrombin activity after allergen challenge:a potential link to airway remodeling?[J].Am J Respir Crit Care Med,2004,169(3):373-377.

[12]Cicala C,Bucci M,De Dominicis G,et al.Bronchoconstrictor effect of thrombin and thrombin receptor activating peptide in guinea-pigs in vivo[J].Br J Pharmacol,1999,126(2):478-484.

[13]Lin CC,Shyr MH,Chien CS,et al.Thrombin-stimulated cell proliferation mediated through activation of Ras/Raf/MEK/MAPK pathway in canine cultured tracheal smooth muscle cells[J].Cell Signal,2002,14(3):265-275.

[14]Chen B,Soto AG,Coronel LJ,et al.Characterization of thrombin-bound dabigatran effects on protease-activated receptor-1 expression and signaling in vitro[J].Mol Pharmacol，2015,88(1):95-105.

[15]Monagle K,Ryan A,Hepponstall M,et al.Inhalational use of antithrombotics in humans:Review of the literature[J].Throm Res，2015,136(6):1059-1066.

[16]Scaglione F.New oral anticoagulants:comparative pharmacology with vitamin K antagonists[J].Clin Pharm,2013,52(2):69-82.

Influence of dabigatran on thrombin induced contraction and proliferation of human airway smooth muscle cells*

YaoZhihui1,ChengYuanxiong1△,LaiWenyan2,CaiKaican3

(1.DepartmentofRespiration;2.DepartmentofCardiology;3.DepartmentofCardiothoracicSurgery,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510515,China)

Objective To investigate the effects of dabigatran on thrombin-induced contraction and proliferation of human airway smooth muscle (HASM) cells.Methods The primary cultured human bronchial smooth muscle cells were used in this experiment.The immunofluorescence method was used to observe the morphological changes of HASM cells contraction,and the α-actin protein relative expression was analyzed by Western blot.The proliferation ability of HASM cells was assessed by cck8 assay.Results Dabigatran could significantly inhibit the thrombin induced HASM cytoskeleton reorganization and α-actin protein expression (P<0.05).In addition,in the comparison of the stimulated proliferation ability of HASM cells among AngⅡ,TGF-β1,PDGF,and Mch and thrombin,thrombin was stronger than AngⅡ,and was second to the 10%FBS (P<0.05).Moreover,thrombin-induced HASM cell proliferation was inhibited by dabigatran in a concentration-dependent and time-dependent manners (P<0.05).Conclusion Dabigatran can significantly inhibit the contraction and proliferation of HASM cells induced by thrombin.

smooth muscle cells;thrombin;dabigatran;ngiotensinⅡ;transforming growth factor-β

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.31.001

廣東省自然科學基金資助項目(s2012010009036)；南方醫院院長基金資助項目(2014A001)。

姚智慧(1988-)，碩士，住院醫師，主要從事哮喘氣道重塑方面的研究。△

，E-mail:drchengyx@qq.com。

R541.75

A

1671-8348(2016)31-4321-03

2016-02-18

2016-06-06)