活血益氣方及其拆方對大鼠心肌梗死邊緣區Spred1及血管新生的影響

鄭瑞玲 陳萌 婁利霞 吳愛明 趙一舟 趙久麗 成文堃 呂晞瀅 張冬梅

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·論著·

活血益氣方及其拆方對大鼠心肌梗死邊緣區Spred1及血管新生的影響

鄭瑞玲 陳萌 婁利霞 吳愛明 趙一舟 趙久麗 成文堃 呂晞瀅 張冬梅

目的 觀察活血益氣方及其拆方對心肌梗死后大鼠梗死邊緣區心肌組織血管新生負性調控因子Spred1及血管新生的影響，探討活血益氣方促血管新生的可能作用機制及配伍規律。方法 健康雄性SD大鼠30只，隨機分為假手術組6只與手術組24只，手術組行左冠狀動脈前降支結扎術制備急性心肌梗死模型，隨機分為模型組、活血益氣方組、益氣方組、活血方組。假手術組只穿線不結扎。連續給予相應藥物4周后，處死大鼠，取梗死邊緣區心肌組織進行指標檢測。采用免疫組織化學法觀察微血管密度(microvasculardensity，MVD)、微血管平均直徑(mean microvascular diameter，MMVD)；采用實時熒光定量PCR法檢測Spred1 mRNA的表達；采用Western Blot法檢測Spred1蛋白的表達。結果 (1)模型組MVD高于假手術組，MMVD小于假手術組(P<0.01)；活血益氣方組、益氣方組、活血方組MVD高于模型組(P<0.01或P<0.05)，其中以活血益氣方組最為明顯，MMVD大于模型組，僅活血益氣方組與之比較具有統計學差異(P<0.01)；益氣方組、活血方組MMVD小于活血益氣方組，分別與之比較，均具有統計學差異(P<0.01)。(2)模型組梗死邊緣區心肌組織Spred1 mRNA表達高于假手術組(P<0.05)；活血益氣方組、益氣方組、活血方組Spred1 mRNA表達高于模型組，差異具有統計學意義(P<0.01或P<0.05)；益氣方組、活血方組Spred1 mRNA表達均高于活血益氣方組，僅活血方組與之比較具有統計學差異(P<0.01)。(3)模型組梗死邊緣區心肌組織Spred1表達高于假手術組，兩者比較未見統計學差異(P>0.05)；活血益氣方組、益氣方組、活血方組Spred1表達均低于模型組，比較差異具有統計學意義(P<0.05)；益氣方組Spred1表達低于活血益氣方組，活血方組Spred1表達高于活血益氣方組，分別與之比較，均未見統計學差異(P>0.05)。結論 活血益氣方及其拆方具有不同程度促進心肌梗死模型大鼠梗死邊緣區血管新生的作用，以活血益氣方作用最為顯著，益氣方、活血方在其中起協同作用，其作用機制可能與下調Spred1、上調其mRNA的表達有關。在Spred1 mRNA上調的情況下，Spred1表達降低，提示Spred1 mRNA可能存在轉錄后調節因子，其具體作用機制尚需進一步研究。

活血益氣方； Spred1； 心肌梗死； 血管新生

冠心病是嚴重影響人類健康的疾病，隨著社會老齡化、生活方式的改變，其發病率和死亡率呈逐年增高趨勢[1]。目前由于經皮冠狀動脈介入治療、冠狀動脈搭橋術等治療對彌漫性病變患者、晚期心肌梗死患者存在局限性，因此，治療性血管新生已成為治療冠心病研究的新方向[2-4]。前期研究表明，活血益氣方具有促進血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表達和缺血心肌血管新生，進而減輕心肌缺血、預防和逆轉心室重構的作用[5-7]。然而血管新生是諸多因子參與的一系列相互銜接、相互影響的過程，Spred1作為重要的血管生成負性調控因子之一，能抑制VEGF介導的Ras-MAPK信號通路從而負性調控血管新生[8-10]。因此，本研究擬在前期研究的基礎上，采用左冠狀動脈前降支結扎術制備大鼠急性心肌梗死模型，觀察活血益氣方及其拆方對梗死邊緣區Spred1及其mRNA表達及血管新生的影響，進一步分析探討活血益氣方促血管新生的作用機制及配伍規律，為臨床上中醫藥促進冠心病缺血心肌血管新生治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物

成年健康雄性SD大鼠30只，6周齡，SPF級，體質量(200±20)g，由中國醫學科學院醫學實驗動物研究所提供，許可證號：11401300011899。實驗期間飼養于北京中醫藥大學東直門醫院中醫內科學教育部重點實驗室SPF級實驗動物房。

1.2 儀器

ALC-V8動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司)；心電圖機(CardiMax Fx-7202)、千分之一電子天平(上海精密科學儀器有限公司JA1003N型)；超薄切片機LEIA RM2135(Feica公司)；高倍顯微鏡BX60(OLYMPUS公司)；圖像采集系統SPOT FLEX(美國Diagnostic Instrument 公司)；TGL-16G 4℃離心機(上海滬粵明科學儀器有限公司)；基因擴增儀GeneAmp PCR system 9700(美國AB公司，Applied Biosystems)；安捷倫實時熒光定量PCR儀Mx3000P(美國安捷倫科技公司)；紫外分光光度計(Pharmacia Biotech 公司)；RT-6000酶標分析儀(深圳Rayto公司)；電泳槽、電轉槽、穩壓穩流定時電泳儀DYY-8C(北京六一儀器廠)。

1.3 藥物和試劑

活血益氣方由黃芪60 g、黨參60 g、丹參10 g、川芎10 g、赤芍10 g、紅花10 g組成；益氣方由黃芪60 g、黨參60 g組成；活血方由丹參10 g、川芎10 g、赤芍10 g、紅花10 g組成。所有藥物均采用北京康仁堂藥業有限公司的免煎顆粒劑，購自北京中醫藥大學東直門醫院。

兔源多克隆抗體CD31(BA2966，生產批號：ZP1797BP97)購自武漢博士德生物工程有限公司；兔源多克隆抗體α-SMA(ab32575，生產批號：GR212262-B)、β-actin(ab6276，生產批號：GR166100-3)、Spred1抗體(ab77079，生產批號：GR163732-1)均購自英國abcam公司；兔二步法免疫組化檢測試劑盒(PV9001，生產批號：K157702D)、DAB顯色試劑盒(ZLI-9017，生產批號：K156820A)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；miRNeasy mini kit試劑盒(217004，生產批號：148025403)、反轉錄試劑盒(218161，生產批號：148027867)均購自德國凱杰(QIAGEN)公司；SYBER Green(041913914001，生產批號：10197100)購自Roche公司；BCA法定量試劑盒(P1511)、蛋白抽提試劑盒-I(P1250)、ECL超敏發光液(P1010)、HRP標記的羊抗兔二抗(C2226)、羊抗鼠二抗(C2130)均購自北京普利萊基因技術有限公司；Spred1引物及GAPDH引物由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。

1.4 模型制備

采用大鼠左冠狀動脈前降支結扎法制備大鼠急性心肌梗死模型[11]。大鼠用7%水合氯醛0.5 mL/100 g腹腔麻醉后，背位固定，經喉行氣管插管術，連接呼吸機，80次/分，潮氣量0.7～0.8 mL行人工呼吸。沿第三、四肋間隙打開胸腔，以開胸器擴大手術視野，撕開心包，在動脈圓錐與左心耳之間下約2 mm處用5/0線結扎左冠狀動脈前降支，當心電圖I導聯顯示ST段顯著抬高后，重置心臟于胸腔，并立即分層縫合胸壁。術后連續三天注射青霉素預防感染，常規飼養。假手術組的手術過程同上，只穿線不結扎。

1.5 分組與給藥

造模成功后，將大鼠隨機分為模型組、活血益氣方組、益氣方組、活血方組，每組6只。活血益氣方組(3.2 g/mL)、益氣方組(2.4 g/mL)、活血方組(0.8 g/mL)分別給予相應的藥物，0.5 mL/100 g灌胃。模型組和假手術組給予等量生理鹽水灌胃，每天一次，于造模后24小時開始，連續4周后，處死大鼠，取大鼠心臟梗死邊緣區心肌組織，進行指標檢測。

1.6 指標檢測

1.6.1 梗死邊緣區心肌組織微血管密度(microvascular density, MVD) 每組隨機選取5只大鼠進行檢測。計數心肌組織用4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋切片后，采用免疫組化PV二步法進行CD31和α-SMA染色。切片常規脫蠟、水化后，使用枸櫞酸鈉緩沖液低火15分鐘進行抗原修復，3%H2O2滅活內源性過氧化物酶，滴加一抗(CD31，1∶100；α-SMA，1∶400)，4℃冰箱內過夜，滴加二抗，DAB顯色，常規脫水、透明封片。陰性對照以PBS代替一抗。梗死邊緣區心肌組織微血管密度的計算采用改進的Weidner[12]方法，先低倍鏡下定位梗死區，然后在高倍鏡下(200倍、400倍)鏡下觀察染成棕黃色的組織，凡出現棕黃色的細胞、細胞叢及小于50 μm的環形陽性區域作為一個血管計數，選擇5個400倍鏡下最高血管密度區進行微血管計數，然后計算平均值作為一個樣本的MVD。

1.6.2 梗死邊緣區心肌組織微血管平均直徑(mean microvascular diameter,MMVD) 每組隨機選取5只大鼠進行檢測。檢測對α-SMA染色切片，先低倍鏡下定位梗死區，然后在高倍鏡下(200倍、400倍)鏡下觀察染成棕黃色的組織，凡出現棕黃色的單個周細胞、周細胞叢及小于50 μm的環形陽性區域作為一個血管，每個樣本隨機選擇2個400倍視野下圖像，利用Image-Pro Plus 6.0軟件，測量血管短軸長度，計算其平均值作為微血管的平均直徑。

1.6.3 實時熒光定量PCR法 檢測Spred1 mRNA的表達取梗塞邊緣區組織，miRNeasy mini kit試劑盒提取包括microRNA在內的總RNA，測定吸光度A260/A280，計算RNA濃度及純度。取1μg總RNA，根據miScriptII RT Kit說明書：5×miScript HiFilex Buffer 4 μL、10×miScript Nucleics Mix 2 μL、miScript Reverse Transcriptase Mix 2μL、RNase-free water，配置20 μL反應體系，在37℃ 60分鐘、95℃ 5分鐘條件下進行反轉錄，得到cDNA鏈。以cDNA為模板進行PCR反應，按FastStart universal SYBR Green Master (ROX)說明書操作：2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、cDNA1 μL、RNase-free water 9.5 μL，配置25 μL的反應體系，放入PCR儀，95℃10分鐘激活FastStart DNA Taq聚合酶后，95℃15秒，60℃1分鐘，40個循環。以GAPDH作為內參照。每個樣品設立2個復孔，取均值，所得CT值按照2-△△ct的方法，進行均一化處理后，再進行統計學分析。Spred1、GAPDH的引物序列見表1。

表1 Spred1及GAPDH引物序列及擴增產物長度

1.6.4 Western blot法 每組隨機選了5只大鼠進行檢測。檢測Spred1蛋白的表達按蛋白抽提試劑盒說明書提取總蛋白，BCA法定量蛋白質。取50 μg蛋白，采用5%的濃縮膠和10%的分離膠的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，然后冰水混合物中恒流250 mA、2小時轉至硝酸纖維素膜膜上；室溫下用5%脫脂奶粉搖動封閉1小時后，加入1∶5000稀釋的兔抗Spred1多克隆抗體，4℃搖動過夜。室溫下TBST3×10分鐘洗膜，加入1∶5000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗，室溫搖床孵育1小時，TBST3×10分鐘洗去未結合的二抗，然后在暗室滴加化學發光劑ECL進行發光顯影。以β-actin為內參照，取出膜TBST3×10分鐘洗膜后，以小鼠抗β-actin單克隆抗體(1∶10000)，辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG二抗(1∶5000)，重新孵育抗體，操作步驟同Spred1。用Photoshop 7.0去色后，用Image J軟件分析條帶的灰度值，以Spred1/β-actin的比值，比較不同組別心肌梗死邊緣區Spred1表達水平。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 對梗死邊緣區心肌組織MVD的影響

以α-SMA檢測梗死邊緣區心肌組織MVD，模型組MVD高于假手術組，兩者比較具有統計學差異(P<0.01)。活血益氣方組、益氣方組、活血方組MVD高于模型組，分別與之比較，僅活血益氣方組、活血方組具有統計學差異(P<0.01、P<0.05)，益氣方組與之比較未見統計學差異(P>0.05)；益氣方組、活血方組MVD均低于活血益氣方組，分別與之比較，差異均具有統計學意義(P<0.01、P<0.05)。見圖1、表2。

注：A.假手術組；B.模型組；C.活血益氣方組；D.益氣方組；E.活血方組

組別nα?SMAMVD(個)CD31MVD(個)假手術組55．92±0．547．84±0．38模型組512．20±0．55a12．80±0．32a益氣方組512．76±0．57e15．52±1．68c活血方組513．32±1．28bd16．52±0．83c活血益氣方組514．44±0．91c16．80±1．33c

注： 與假手術組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01；與活血益氣方組比較，dP<0.05，eP<0.01。

以CD31檢測梗死邊緣區心肌組織微血管密度，模型組MVD高于假手術組，兩者比較具有統計學差異(P<0.01)；活血益氣方組、益氣方組、活血方組MVD高于模型組，與之比較，均具有統計學差異(P<0.01)；益氣方組、活血方組MVD均低于活血益氣方組，與之比較，未見統計學差異(P>0.05)。見圖1、表2。

注：A.假手術組；B.模型組；C.活血益氣方組；D.益氣方組；E.活血方組

2.2 對梗死邊緣區心肌組織MMVD的影響

模型組梗死邊緣區心肌組織MMVD顯著小于假手術組，差異具有統計學意義(P<0.01)。活血益氣方組、益氣方組、活血方組MMVD不同程度大于模型組，活血益氣方組與之比較，差異具有統計學意義(P<0.01)，而益氣方組及活血方組與之比較，差異無統計學意義(P>0.05)。益氣方組、活血方組MMVD小于活血益氣方組，分別與之比較差異具有統計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠心肌梗死邊緣區微血管平均直徑(MMVD)的比較

注：與假手術組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01；與活血益氣方組比較，cP<0.01。

2.3 對梗死邊緣區心肌組織Spred1 mRNA表達的影響

模型組Spred1 mRNA的表達高于假手術組，差異具有統計學意義(P<0.05)；活血益氣方及其拆方各組Spred1 mRNA的表達高于模型組，與之比較差異均有統計學意義(P<0.01、P<0.05)。益氣方組、活血方組Spred1 mRNA的表達均高于活血益氣方組，益氣方組與之比較差異無統計學意義(P>0.05)；活血方組與之比較，差異具有統計學意義(P<0.01)。見表4。

表4 各組大鼠心肌梗死邊緣區Spred1 mRNA表達水平的比較±s)

注： 與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01；與活血益氣方組比較，dP<0.01。

2.4 對梗死邊緣區心肌組織Spred1蛋白表達的影響

模型組梗死邊緣區心肌組織Spred1表達高于假手術組，兩者比較未見統計學差異(P>0.05)；活血益氣方組、益氣方組、活血方組Spred1低于模型組，分別與之比較，均具有統計學差異(P<0.01、P<0.05)。益氣方組Spred1表達低于活血益氣方組，活血方組Spred1表達高于活血益氣方組，差異比較均無統計學意義(P>0.05)。見圖3、表5。

注：A.假手術組；B.模型組；C.活血益氣方組；D.益氣方組；E.活血方組

組別nSpred1假手術組51．00±0．00模型組51．08±0．16益氣組50．71±0．21b活血組50．84±0．14a活血益氣方組50．78±0．22a

注： 與模型組比較，aP<0.05，bP<0.01。

3 討論

治療性血管新生[13-14]，又稱“藥物促進心臟自身搭橋”，可以有效建立側枝循環，改善患者的缺血、缺氧狀態，減少心肌梗死、預防或逆轉心室重構，在改善患者心功能及預后等方面，發揮著重要作用，為臨床治療缺血性疾病提供了新的思路。

在血管新生的研究中，MVD是普遍采用的比較直觀和有效反映新生血管數目和側枝循環建立情況的指標，常以內皮細胞特異性標志物CD31來反映組織中微血管密度[15-16]。研究發現，心肌梗死等許多疾病在病理狀態下新生血管存在結構及功能上的異常，常表現為血管形態不規則、結構紊亂、內皮細胞外缺乏周細胞及血管平滑肌細胞覆蓋等異常的新生血管，并不能有效地建立側枝循環，改善患者的缺血缺氧狀態[17-19]。因此，有研究者提出，僅僅依靠血管計數并不能準確反映血管新生情況，應該從血管直徑、血管成熟情況等多個方面來觀察血管新生情況[20]。α-SMA僅存在于血管平滑肌細胞及周細胞的微絲束中，可作為這兩種細胞的特異性標記物[21-23]，利用α-SMA對周細胞及平滑肌細胞進行標記是目前最常用的判斷血管成熟的方法[24-25]。因此，本研究借鑒判斷微血管成熟的方法α-SMA染色，并結合CD31染色，對心肌梗死邊緣區血管新生情況進行觀察。研究結果表明，模型組較假手術組微血管明顯增高，但微血管平均直徑顯著小于假手術組，提示在心肌梗死大鼠中，缺血缺氧條件可以引起梗死邊緣區心肌組織病理性的血管新生；活血益氣方組及其拆方對梗死邊緣區心肌組織CD31標記微血管密度及α-SMA標記微血管密度均不同程度增高，且管腔直徑較模型組不同程度增大，其中以活血益氣方組效果最好，提示活血益氣方及其拆方能夠促進心梗大鼠梗死邊緣區心肌組織血管新生，其中益氣方和活血方在此方面具有協同作用。

Spred1是一種sprouty相關的酪氨酸激酶結合蛋白，可以特異性地抑制MAPK信號通路[26]。越來越多的研究表明，Ras-MAPK信號通路在血管建立及缺血后血管新生中具有重要作用[27]，血管生長因子如VEGF、成纖維細胞生長因子通過激活Ras-MAPK信號通路，促進細胞的遷移、增殖及黏附性，并最終促進血管新生及血管的完整性。而Ras-MAPK信號通路的治療性激活面臨諸多問題，如Ras-MAPK的激活因子、VEGF存在半衰期短，基因治療存在安全可控的問題。因此，有研究者嘗試通過調控Ras-MAPK信號通路的重要負性調控因子Spred1，來促進血管新生[28-29]。Wang S等[28]研究發現在Spred1過表達的情況下，內皮細胞遷移能力降低，而通過siRNA抑制Spred1的表達，可提高內皮細胞的遷移能力，促進血管新生；Jakob P等[29]通過上調和下調內皮祖細胞miR-126、siRNA抑制Spred1表達等一系列實驗表明，抑制Spred1可促進內皮祖細胞的增殖、遷移及細胞集落形成能力。

本實驗研究結果顯示，模型組Spred1及其mRNA表達均較假手術組增加，提示缺血缺氧引起的病理性血管新生情況下，血管新生的抑制因子表達增加；活血益氣方及其拆方可上調Spred1 mRNA的表達，降低Spred1蛋白的表達，促進血管新生，推測其可能的作用機制與影響Spred1 mRNA的轉錄后調節因子有關，但具體機制尚待進一步研究。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Effects ofHuoxueYiqiprescription and its disassemble prescriptions on Spred1 and angiogenesis in rats with acute myocardial infarction

ZHENGRui-ling,CHENMeng,LOULi-xia,etal.

DongzhimenHospitalAttachedtoBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100700,China

ZHANGDong-mei,E-mail:chaweto@126.com

Objective To observe the impact ofHuoxueYiqiprescription on the negative regulation factor Spred1 and angiogenesis of myocardial tissue in the marginal zone of myocardial infarction rats, and to explore the mechanism and compatibility regularity of the compound decoction ofHuoxueYiqiprescription promoting therapeutic neovascularization. Methods Model rats of acute myocardial infarction (AMI) were established by ligation of left anterior descending coronary artery, and randomly divided into 4 groups. Therapeutic groups were treated withHuoxueYiqiprescription (HXYQ),Yiqiprescription (YQ),Huoxueprescription (HX) and model group. Rats of sham group were treated with saline and operated without ligation. Animals were sacrificed and the myocardial infarction border areas were taken as indicators after 4 weeks of treatment. Microvascular density (MVD) and the mean microvessel diameter (MMVD) were assessed by immunohistochemistry. The expression of Spred1 mRNA and VEGF mRNA was detected by quantitative real-time PCR (qRT-PCR), and Western Blot was used to observe the expression of Spred1. Results (1) The MVD in model group was higher than that in sham group (P<0.01). Compared with model group, HXYQ, HX and YQ group can improve MVD (P<0.01 orP<0.05), and the effect of HXYQ is the most significant. The MMVD in model group was higher than sham group (P<0.01). Compared with model group, HXYQ,HX and YQ group could improve MMVD, but only HXYQ group had significant difference (P<0.01). The MMVD in HXYQ group was higher than that in the other two therapeutic groups (P<0.01). (2) The mRNA level of Spred1 in model group was higher than that in sham group (P<0.05). Compared with model group, HXYQ, HX and YQ group could significantly improve the mRNA level of Spred1 (P<0.05). The mRNA level of Spred1 in HXYQ group was lower than that in HX group or YQ group. However it was only significantly lower than in HX group (P<0.01). (3)The expression of Spred1 in model group was higher than sham group, but there was no significant difference (P>0.05). Compared with model group, HXYQ, HX and YQ group could significantly reduce the expression of Spred1 (P<0.05). The expression of Spred1 in HXYQ group was higher than that in YQ group and lower than in HX group, but there was no significant difference (P>0.05). Conclusion To varying degrees, HXYQ and its decomposed recipes can promote angiogenesis in myocardial infarction border areas in rats after AMI. The effect of HXYQ is the most significant. It’s two decomposed recipes work synergistically. The mechanisms may be related with their effects on down-regulating Spred1 and up-regulating the mRNA level of Spred1. In addition, we found that the mRNA level of Spred1 increased while the expression of Spred1 decreased. It is suggesting that Spred1 mRNA may be regulated at the post-transcriptional level by other factor, therefore further researches regarding the specific mechanism may be needed.

HuoxueYiqiprescription; Spred1; Myocardial infarction; Angiogenesis

國家自然科學基金面上項目(81273694)

100700 北京中醫藥大學東直門醫院中醫內科學教育部和北京市重點實驗室[婁利霞、吳愛明、趙一舟、趙久麗、成文堃(碩士研究生)、呂晞瀅、張冬梅]；北京中醫藥大學基礎醫學院(陳萌)；鄭州市中牟縣中醫院內一科(鄭瑞玲)

鄭瑞玲(1986- )，女，碩士，住院醫師。研究方向：中西醫結合心血管疾病的應用基礎研究。E-mail：752682356@qq.com

張冬梅(1975- )，女，博士，副研究員。研究方向：中西醫結合心血管疾病的應用基礎研究。E-mail：chaweto@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.12.001

2016-05-08)