重慶市2009～2014年甲型H1N1流感病毒分離株HA基因變異分析*

葉 盛，喻 臻，陳 爽，凌 華△，熊 宇，李 勤

(重慶市疾病預防控制中心：1.微生物檢測所;2.傳染病預防控制所，重慶 400042)

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論著·臨床研究 doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.30.016

重慶市2009～2014年甲型H1N1流感病毒分離株HA基因變異分析*

葉 盛1，喻 臻1，陳 爽1，凌 華1△，熊 宇2，李 勤2

(重慶市疾病預防控制中心：1.微生物檢測所;2.傳染病預防控制所，重慶 400042)

目的 對2009～2014年分離得到的甲型H1N1流感病毒進行血凝素(HA)基因測序分析，與世界衛生組織(WHO)推薦疫苗株A/California/07/2009(H1N1)比對，研究其基因變異情況。方法 按分離時間及地點不同，選取47株2011～2014年分離得到的甲型H1N1流感病毒進行測序，同時選取既往已有的25株2009年甲型H1N1流感病毒的序列結果，經分子生物學軟件進行核苷酸及氨基酸序列分析，并繪制系統進化樹。結果 2009、2011～2014年的新型甲型H1N1流感病毒與疫苗株均位于一個大的分枝下，各病毒間的關系均較近。72株分離株的HA基因總的核苷酸差異在0～2.7%之間，氨基酸差異在0～3.1%之間；與疫苗株A/California/07/2009(H1N1)的核苷酸差異在0.4%～2.4%之間，氨基酸差異在0.9%～3.1%之間。氨基酸變異情況隨著年份增加累積得更多，但在氨基酸序列上仍顯示為低致病性流感病毒特征；2009年有9株病毒株丟失481位的糖基化位點，2013年有6株病毒株增加位于162位的糖基化位點。結論 WHO推薦的甲型H1N1疫苗總體上對重慶地區的人群仍有較好的保護作用，但隨著時間推移，部分甲型H1N1流感病毒株可能已發生抗原漂移，需繼續對其監測。

甲型H1N1；流感病毒；序列分析；HA基因

流行性感冒(簡稱流感)是由流感病毒引起的具有高度傳染性的急性呼吸道傳染病，傳播迅速，短時間內可造成局部地區的暴發或全球范圍的流行，也是人類迄今為止尚無法有效控制的傳染病之一。流感病毒屬正黏病毒科(orthomyxoviridae)，按核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，NP)和基質蛋白(matrix protein，MP)不同，分為甲(A)、乙(B )、丙(C)3 型。流感病毒的流行與流感病毒的抗原變異密切相關,甲型流感病毒抗原變異主要有抗原漂移和抗原轉變，一般認為抗原漂移常帶來甲型流感病毒不同程度的流行。甲型流感病毒的亞型由血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)兩種主要表面蛋白決定。HA基因是流感病毒的主要抗原基因，其編碼的HA蛋白具有免疫原性，能使人體產生保護性抗體[1]；同時其承受的免疫壓力也較大，進化和變異速度相對較快。

2009年暴發于墨西哥、美國的新型甲型流感，其病原為重組的新型流感病毒[2]，該病毒傳播迅速，幾個月內即在世界范圍內流行。該病毒于2009年5月進入我國大陸[3]，2009年6月重慶即出現首例甲型H1N1流感病例，自此，該病毒由輸入性個案病例迅速本土化并造成重慶市本地區內的暴發流行[4-5]。隨著人群自然免疫和疫苗的接種，甲型H1N1流感病毒活動性似乎逐漸減弱，但其對人群的危害仍未消除。持續關注甲型H1N1流感病毒的HA基因和HA蛋白的變異情況，可為流感疫苗的篩選及病毒演化趨勢判斷提供重要的參考依據。

1 材料與方法

1.1 病毒來源 2011～2014年，對重慶市疾病預防控制中心流感網絡實驗室各哨點醫院的樣品及各區縣流感暴發樣品進行核酸檢測和病毒分離，得到流感病毒株。將得到的毒株中的甲型H1N1病毒株按分離時間及地點不同，選取代表毒株。

表1 甲型H1N1流感病毒HA基因擴增引物序列

1.2 方法

1.2.1 目的基因擴增 將選取的病毒分離株用全自動樣品處理工作站(QIA Symphony SP，QIAGEN，德國)及該工作站配套RNA提取試劑(QIAsymphony Virus/Bact Mini Kit，QIAGEN，德國)提取病毒RNA，經逆轉錄試劑盒(SuperScript Ⅲ First-Strand Synthesis System，Invitrogen，美國)逆轉錄后制備出病毒cDNA，再取病毒cDNA為模板，用普通聚合酶鏈式反應(PCR)預混裝試劑盒(GoTaq?Hot Start Green Master Mix，Promega，美國)和表1中的引物(Invitrogen合成，美國)完成病毒HA基因核酸的PCR擴增，經電泳(E-Gel?瓊脂糖凝膠電泳系統，Invitrogen，美國)后，觀察到目的條帶確認目的片斷擴增成功。

1.2.2 基因測序與序列分析 含有目的片斷的PCR反應產物直接送Takara和Invitrogen公司進行基因測序。測序所得序列經校對后采用BIOEDIT 7.0軟件進行序列比對和剪切；采用MEGA 4.0.2基于Neighbour-joining(NJ)法生成系統發生樹，并進行序列分析和氨基酸位點差異分析；使用DNASTAR 5.0軟件包的MegAlign軟件進行核苷酸和氨基酸序列差異分析。

2 結 果

2.1 流感監測結果與病毒分離結果 除去2009年6月至2010年3月甲型H1N1在重慶地區的首次暴發流行期，從2010年11月至2015年11月共計61個自然月中，甲型H1N1共計出現兩次流行，分別是2010年12月至2011年3月，和2012年12月至2014年4月(圖1)；在這61個自然月中，共采集標本26 108份，共分離到流感病毒2 098株，總體病毒分離率為8.04%，共分離得到甲型H1N1毒株288株，占所分離到病毒總數的13.7%。在上述288株病毒株中選取47株甲型H1N1病毒株經基因測序后序列整理與拼接，得到其HA基因組序列信息。

2.2 基因進化分析 經與世界衛生組織(WHO)推薦疫苗株A/California/07/2009(H1N1) ，以下簡稱CA/07/09(HA基因Genbank收錄號為GI:758899355)比對，47株2011～2014年分離病毒株均未出現核苷酸插入與缺失。將上述47株病毒的HA基因序列與已經有的2009～2010年流行期的25株H1N1病毒的HA基因序列和A/Beijing/262/1995(H1N1)和A/swine/Jiangsu/s16/2011(H1N1)的HA序列對齊剪切后生成基因進化樹(圖2)。在圖2所示的進化樹上，除A/Beijing/262/1995(H1N1)和A/swine/Jiangsu/s16/2011(H1N1)兩株毒株外，2009年、2011～2014年的新型甲型H1N1流感病毒與疫苗株均處于一個大的分枝下，各病毒間的關系均較近，相鄰年份的病毒聚集并交叉分布在相鄰的分枝上：2009與2011年分離病毒株包括疫苗株均交叉分布于一個大的分枝上，而2013～2014年的病毒株分布于另一大分枝上。

圖1 重慶市2010年11月至2015年11月流感檢測情況

2.3 核苷酸及氨基酸差異情況 72株分離株的HA基因總的核苷酸差異在0～2.7%之間，氨基酸差異在0～3.1%之間；與疫苗株CA/07/09的核苷酸差異在0.4%～2.4%之間，氨基酸差異在0.9%～3.1%之間，見表2。

表2 2009～2014年甲型H1N1流感病毒株核苷酸及氨基酸差異情況(%)

2.4 氨基酸變異情況 2009～2014年72株甲型H1N1分離株與疫苗株CA/07/09的HA氨基酸序列存在3個共同的差異位點，分別是P83S (減去信號肽序列號，以下序列位點相同)、S203T及I321V。除此之外，各年度分離到的病毒株與CA/07/2009在不同的氨基酸位點各有差異。2011年的10株病毒株在2009年的變異基礎上全部增加R223Q、E374K變異；2013年的33株病毒株全部出現D97N、S185P/T、E374K、S451N變異；2014年的4株病毒株則全部出現D97N，K163Q，S185T，R223Q，A256T，K374E，S451N，E499K變異，見表3。

表3 2009～2014年毒株相對疫苗株CA/07/09氨基酸位點變化情況

圖2 基于HA基因的系統進化樹

2.5 致病性分析 本次研究的所有甲型H1N1流感病毒均表現為低致病性特征。病毒裂解位點氨基酸序列為VPSIQSR↓GLFGAIA，HA1與HA2間僅由一個堿性氨基酸R(第327位)連接，其水解位點附近未見多個連續堿性氨基酸，屬于低致病性流感病毒特征[6]。

2.6 糖基化位點分析 本次研究中的所有甲型H1N1病毒，其糖基化位點大部分與疫苗株CA/07/09相同，共有8個穩定的糖基化位點，其中，HA1區有6個糖基化位點，分別位于10、11、23、87、276和287位點，HA2區有2個糖基化位點，分別位于481和540位點。2009年有9株病毒株(9/25)丟失481位點的糖基化位點，2013年有6株毒株(6/33)增加位于162位的糖基化位點，見圖3。

方框“□”區域：潛在糖基化位點；圖中數字6 ：毒株“A/重慶九龍坡/SWL382/2009”，數字56：毒株“A/重慶渝中/SWL11297/2013(H1)”。

圖3 WHO推薦疫苗株與部分病毒分離株的HA基因編碼氨基酸序列對比

3 討 論

自2009～2010年初的甲型H1N1暴發流行過后，重慶地區從2010年11月至2015年11月又出現了兩輪甲型H1N1流感病毒流行高峰，這與我國其他地區的情況基本相同[7]。本次研究選擇了2011～2014年分離的共47株甲型H1N1流感病毒株，以及25株2009年的甲型H1N1病毒核苷酸資料，對共計72株甲型H1N1病毒的HA基因進行了分析。從核苷酸及氨基酸差異性上看，所有毒株與疫苗株A/California/07/2009(H1N1)仍保持較高的同源性。在基因進化樹上，所有甲型H1N1包括疫苗株均在同一大分枝上，各病毒株與疫苗株的距離不大，提示疫苗對重慶地區的甲型H1N1應仍有效；但2013年與2014年的病毒比2009年和2011年的病毒離疫苗株更遠，提示隨著年份增加，H1N1病毒與疫苗株的基因序列差異在增加，這也與福建、江蘇、陜西等地的甲型H1N1病毒與疫苗株的情況類似[8-9]。氨基酸變異情況對比顯示，本次研究中甲型H1N1流感病毒共有的氨基酸序列變異，隨著年份增加而累積得更多，其中，2013年與2014年的毒株變異情況也與江蘇省的甲型H1N1流感病毒變異情況相似。這說明因氨基酸序列改變而發生的抗原性變化逐年積累的可能性較大。

與甲型H1N1流感病毒HA抗原性密切相關的4個抗原決定簇位于HA1區域，分別是Ca(137～142、166～170、203～205、221～222、235～237)、Cb(70～75)、Sa(124～125、153～157、159～164)、Sb(184～195)[10-12]。一般認為，HA1區蛋白分子上有4個以上氨基酸位點發生變異，且變異涉及2個或2個以上抗原決定簇上的位點，或一個涉及抗原決定簇另一個涉及受體結合位點，將可能會出現新的抗原漂移株[13]。本次研究中，2009、2011和2014年的毒株均未出現上述情況。但2013年的毒株有14株毒株(14/33)出現4處及以上的氨基酸位點變異，且涉及2個及以上抗原決定簇。其中，A/重慶渝中/SWL59/2013(H1)出現A73E、K163Q、S185T、S203T 4個位點的變異，且4個位點分別位于Cb、Sa、Sb和Ca區。因此，該甲型H1N1流感病毒株可能出現抗原漂移現象，但2014年的毒株暫未觀察到上述位點的持續變異，上述抗原漂移是否能夠持續存在及積累，還需要對將來可能出現的甲型H1N1流感病毒繼續監測。

糖基化在穩定蛋白的三維結構和其被水解，以及阻礙抗體的識別中起到重要作用。糖基化位點的改變或增減會對病毒的抗原性和生物特性帶來一定的影響；特別是當糖基化位點的改變發生在抗原決定簇時，可能會造成病毒抗原性改變，產生抗原漂移[14-15]。本次研究中，有9株2009年的甲型H1N1病毒株丟失481位的糖基化位點，但由于481位點不在抗原決定簇上，481位的糖基化位點丟失對于毒株的抗原性改變影響可能不大；但另有6株2013年的毒株出現162位點糖基化，且162位點剛好位于Sa區，因此，該6株病毒有可能出現抗原性改變。同時，該6株病毒株中，A/重慶渝中/SWL11297/2013(H1)、A/重慶渝中/SWL11434/2013(H1)、A/重慶渝中/SWL58/2013(H1)和A/重慶渝中/SWL11827/2013(H1)病毒株同時出現了3個抗原決定簇的氨基酸變異，這幾株病毒的抗原性是否有改變，需對其進行進一步的抗原性分析。

綜上所述，本次研究提示，2009～2014年重慶市甲型H1N1流感病毒與疫苗株A/California/07/2009(H1N1)相比，雖然變異程度逐年積累，但總體上甲型H1N1流行株與疫苗株仍保持較高的同源性，疫苗對本地區人群仍有較好的保護作用。但隨著時間推移，相對于疫苗株，2013和2014年的甲型H1N1病毒株已經出現一定的變異，部分病毒株的HA蛋白可能已發生抗原漂移。因此，持續監測甲型H1N1流感病毒，可以及時準確地發現抗原漂移株，掌握甲型H1N1流感病毒的流行與進化規律，預測其發生、發展情況，為可能的暴發流行做好充分的準備，為科學有序地防控甲型H1N1流感提供依據。

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Variation of HA gene of influenza A H1N1 influenza virus isolated from 2009 to 2014 in Chongqing city*

Ye Sheng1,Yu Zhen1,Chen Shuang1,Ling Hua1△,Xiong Yu2,Li Qin2

(1.DepartmentofMicrobeDetection;2.DepartmentofInfectionDiseaseControlandPrevention,ChongqingCenterforDiseaseControlandPrevention,Chongqing400042,China)

Objective In order to analyze the variation of HA genes of influenza viruses (H1N1) by being compared with the vaccine strain A/California/07/2009(H1N1) recommended by WHO,influenza viruses (H1N1) isolated from 2009 to 2014 were selected to do this study.Methods According to the different isolating time and place,47 strains of H1N1 collected from 2011 to 2014 were selected.Then the 47 strains′ nucleotide sequence of HA genes which were sequenced in the study and other 25 sequences of HA genes which were sequenced in 2009 were collected.Nucleotide and amino acid sequences were analyzed by using molecular biology software,and the phylogenetic trees were drawn.Results A total of 72 strains isolated from 2009 to 2014 were closely related to the vaccine strain A/California/07/2009(H1N1),the nucleotide variance and amino acid variance between the 72 strains were 0-2.7% and 0-3.1% respectively.Compared with the vaccine strain A/California/07/2009(H1N1),the nucleotide variance and amino acid sequence variance were 0.4%-2.4% and 0.9%-3.1% respectively.The amino acids sequence indicated that,although the variance was increased by years,the H1N1 viruses were still showed characteristics of low pathogenic influenza viruses.It was also found that there were 9 strains lost their potential glycosylation site at HA protein site 481 in 2009,while in 2013 there were 6 strains got new potential glycosylation sites at HA protein site 162.Conclusion The vaccines (H1N1) recommended by WHO was still protective to people in Chongqing.But as time goes by,antigen drift may occur in some new antigenic drift strains and the routine monitoring of influenza viruses should be continued.

H1N1；influenza virus；sequence analysis；HA gene

重慶市衛計委醫學科研基金資助項目(2011-2-316)。 作者簡介：葉盛(1981-)，主管技師，碩士，主要從事流感、禽流感的檢測與研究。△

R373.1+3

A

1671-8348(2016)30-4226-04

2016-04-01

2016-06-29)