結核患者外周血CD4+CD25+Foxp3+表達與巨噬細胞凋亡的臨床意義*

周 安，徐巧玲，李明強，劉清蒙△

(1.遵義醫學院微生物學教研室，貴州遵義 563000；2.貴州航天醫院肺科，貴州遵義 563000)

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論著·臨床研究 doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.30.013

結核患者外周血CD4+CD25+Foxp3+表達與巨噬細胞凋亡的臨床意義*

周 安1，徐巧玲2，李明強1，劉清蒙1△

(1.遵義醫學院微生物學教研室，貴州遵義 563000；2.貴州航天醫院肺科，貴州遵義 563000)

目的 探討結核病患者外周血單個核細胞(PBMC)中CD4+CD25+Foxp3+調節性T淋巴細胞(Treg)表達與單核巨噬細胞(MΦ)凋亡的可能關系及臨床意義。方法 用流式儀測定29例活動性結核、17例肺外結核患者治療前及治療后3、6個月PBMC中CD4+CD25+Foxp3+Treg表達及MΦ凋亡率，并與20例健康對照者(健康對照組)進行比較。結果 活動性結核患者PBMC中CD4+CD25+Foxp3+Treg表達明顯高于健康對照組和治療后患者，且復治患者高于初治患者，肺外結核高于肺結核；患者MΦ凋亡率明顯高于健康對照組(P<0.01)，初治組明顯高于復治組(P<0.01)。活動性結核患者PBMC中CD4+CD25+Foxp3+Treg表達與MΦ凋亡呈負相關。結論 CD4+CD25+Foxp3+Treg表達升高，MΦ凋亡下降，提示與結核病呈慢性感染有關。

活動性結核；外周血單個核細胞；CD4+CD25+Foxp3+調節性T淋巴細胞；單核巨噬細胞凋亡

據世界衛生組織(WHO)2010年全球結核病控制報告顯示，結核病仍是危害人類健康的主要疾病之一[1]。CD4+CD25+Foxp3+調節性T淋巴細胞(regulatory T cell，Treg)是一種具有多種免疫調節功能的Treg，經細胞接觸依賴或抑制性細胞因子依賴機制主動抑制自身免疫性T淋巴細胞活化，維持自身免疫耐受，防止自身免疫性疾病的產生，但CD4+CD25+Foxp3+Treg表達增高可抑制機體抗感染免疫應答[2-5]。近年來發現，細胞凋亡在結核病的發生、發展中起著重要作用，而活動性肺結核患者，初治及復治結核病患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中CD4+CD25+Foxp3+Treg表達與單核巨噬細胞(macrophage,Mф)凋亡之間有何關聯及臨床意義，鮮見報道，本文就此進行了初步探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 觀察組46例，為就診于遵義醫學院附屬醫院和貴州航天醫院的結核病患者，男27例，女19例，平均年齡(37.2±4.8)歲，患者診斷均符合《WS288-2008肺結核診斷標準》。其中，肺結核29例納入肺結核組；血性播散性結核5例，結核性胸膜炎8例，淋巴結結核3例，盆腔結核l例均納入肺外結核組；按化療史分類，初治患者28例(初治組)，復治患者18例(復治組)。健康對照組20例，男13例，女7例；平均年齡(32.8±7.3)歲，均未感染傳染病和罹患其他慢性疾病，均未服用糖皮質激素等藥物。

1.2 儀器與試劑 抗CD4-藻紅蛋白(CD4-PE)、抗CD25-異硫氰酸熒光素( CD25-FITC)和抗Foxp3-AOC(美國BD公司)；紅細胞裂解液(美國Solarbio公司)；流式細胞儀(美國Beckman-Coulter和BD公司)； Annexin-V-FITC細胞凋亡試劑盒(南京凱基生物)。

1.3 方法

1.3.1 CD4+CD25+Foxp3+Treg的檢測 嚴格按試劑盒說明書操作。取清晨空腹肝素抗凝靜脈血3 mL，加入紅細胞裂解液混勻，4 ℃放置15 min，其間混勻2次，離心洗滌細胞，調細胞數至1×104，加入抗CD4-FITC和抗CD25-PE單克隆抗體各10 μL，室溫暗室孵育20 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，加入抗Foxp3-AOC單克隆抗體10 μL,室溫暗室孵育2.5 h，洗滌重懸細胞后經流式儀測定。

1.3.2 Mф凋亡檢測 嚴格按試劑盒說明書操作。Mф的分離培養參照文獻[6]進行，用Ficoll分離單個核細胞，洗滌重懸后，以每孔1×105個的細胞量加入24 孔培養板，在5% CO2培養箱中37 ℃孵育3 h，貼壁細胞洗滌3次，按試劑盒說明書加入各試劑，室溫避光反應15 min，離心、洗滌沉淀細胞經流式儀測定。

2 結 果

2.1 肺與肺外結核患者PBMC中CD4+CD25+Foxp3+Treg表達及Mф凋亡 肺結核組CD4+CD25+Foxp3+Treg表達及Mф凋亡率明顯高于健康對照組(P<0.01)；肺外結核組CD4+CD25+Foxp3+Treg表達明顯高于肺結核組(P<0.01)，而Mф凋亡率卻低于肺結核組(P<0.05)，見表1。

表1 結核患者PBMC中CD4+CD25+Foxp3+Treg表達與Mф凋亡率

*：P<0.01，與健康對照組比較；#：P<0.01，△：P<0.05，與肺外結核組比較。

2.2 初治和復治結核患者PBMC中CD4+CD25+Foxp3+Treg表達及Mф凋亡 初治組CD4+CD25+Foxp3+Treg表達明顯低于復治組(P<0.01)；初治組Mф凋亡率明顯高于復治組(P<0.01)；但兩組CD4+CD25+Foxp3+Treg表達及Mф凋亡率均明顯高于健康對照組(P<0.01)，見表2。

2.3 治療前后肺結核病患者PBMC中CD4+CD25+Foxp3+Treg表達及Mф凋亡 經重復測量資料方差分析及兩兩比較，治療前CD4+CD25+Foxp3+Treg表達明顯高于治療后3、6個月(P<0.01)，但治療后3個月與治療后6個月比較，差異無統計學意義(P>0.05)。Mф凋亡率治療前明顯高于治療后3、6個月(P<0.01)，治療后3個月與治療后6個月比較，差異亦有統計學意義(P<0.05)。見表3。治療后6個月患者Mф凋亡率[(4.78±2.39)%]與健康對照組[(3.34±1.26)%]比較，差異無統計學意義(t=2.004，P=0.051)。

表2 不同結核患者PBMC中CD4+CD25+Foxp3+Treg表達與Mф凋亡率

*：P<0.01，與健康對照組比較；#：P<0.01，與復治結核組比較。

表3 治療后肺結核患者PBMC中CD4+CD25+Foxp3+Treg表達與Mф凋亡率

*：P<0.01，與治療前比較，#：P<0.05，與治療后3個月比較。

2.4 結核患者PBMC中CD4+CD25+Foxp3+Treg與Mф凋亡流式細胞 初治患者CD4+CD25+Foxp3+Treg表達率為8.3%；復治患者為13.7%，見圖1。初治患者Mф凋亡率為22.82%；復治患者為12.68%，見圖2。

A：初治患者；B：復治患者。

圖1 CD4+CD25+Foxp3+Treg 流式細胞圖

A：初治患者；B：復治患者。

圖2 Mф凋亡流式細胞圖

圖3 結核患者PBMC中CD4+CD25+Foxp3+Treg表達與Mф凋亡率的相關性分析

2.5 CD4+CD25+Foxp3+Treg表達與Mф凋亡的相關性分析 對結核患者PBMC中CD4+CD25+Foxp3+Treg表達與Mф凋亡率做相關性分析，結果顯示CD4+CD25+Foxp3+Treg表達與Mф凋亡率呈負相關(r=-0.478，P<0.05)，見圖3。

3 討 論

Foxp3是Treg特異表型和功能標志，Treg的數量和功能失調與多種重大疾病的發生、發展和結局密切相關[7-9]。免疫抑制性是CD4+CD25+Foxp3+Treg最重要的特性，可抑制機體抗感染免疫和抗腫瘤免疫效應，現認為CD4+CD25+Foxp3+Treg與多種慢性感染性疾病的發生、發展有關，與結核病發病亦可能有關[2,10]，其詳細機制尚不清楚。本試驗結果顯示，活動性結核患者PBMC中CD4+CD25+Foxp3+Treg表達明顯高于健康對照組和治療后患者，且復治組明顯高于初治患者。說明活動性結核患者由于CD4+CD25+Foxp3+Treg表達水平增高，抑制機體抗結核免疫功能，可導致效應性CD4+T、CD8+T及NK等殺傷性細胞的活化受抑制，引起特異性細胞免疫及其產生的免疫效應水平下降，最終抑制Mф的激活，這與結核病的發生和發展應密切相關。郭凈等[11]用抗結核合劑減少初治肺結核患者PBMC中CD4+CD25+Treg的細胞數量，并下調Foxp3 mRNA的表達，從而調節機體抗結核免疫功能，取得一定的臨床療效。提示CD4+CD25+Foxp3+Treg參與了結核病的發生和發展。

Mф具有天然免疫和獲得性免疫兩大功能，且協調宿主有效免疫應答。本文研究結果顯示，活動性結核患者PBMC中Mф凋亡率明顯高于健康對照組(P<0.01)。初治組明顯高于復治組(P<0.01)。患者治療3個月高于治療6個月與健康對照組(P<0.05)，治療6個月后與健康對照組無明顯差異(P>0.05)。肺外結核組CD4+CD25+Foxp3+Treg表達明顯高于肺結核組(P<0.01)，而Mф凋亡率卻明顯低于肺結核組(P<0.05)，且兩者呈負相關(圖3)。上述結果均提示結核病初期，Mф凋亡明顯高于健康人群，這對殺滅入侵機體的結核分枝桿菌有利，隨著病程延長，患者PBMC中CD4+CD25+Foxp3+Treg表達升高，Mф凋亡下降，機體天然和獲得性免疫功能均受損，入侵結核分枝桿菌逃逸機體免疫功能殺傷，在體內頑強生長繁殖并休眠于Mф中，導致結核病遷延不愈。有研究報道，局部浸潤的Treg通過抑制結核分枝桿菌抗原特異性效應T淋巴細胞的免疫反應，一方面限制過強免疫應答所造成的過度自身組織病理損傷，另一方面可使結核分枝桿菌逃逸免疫攻擊，從而導致和維持細菌在體內的慢性感染[2]。

目前，尚不清楚結核病免疫功能紊亂的詳細機制、決定結核分枝桿菌感染呈慢性化的因素和結核特異免疫應答被抑制的原因。本文結果與相關報道相一致[12-14]，活動性結核患者存在CD4+CD25+Foxp3+Treg數量升高和功能增強，導致特異性細胞免疫功能受抑制，降低機體殺菌能力，同時抑制Mф凋亡，削弱機體免疫系統對入侵機體的結核分枝桿菌的清除，使感染慢性化。如能揭示結核分枝桿菌與宿主CD4+CD25+Foxp3+Treg和Mф相互作用的詳細機制，將為闡明結核病的發病機制提供理論依據，并為防治結核病提供新的靶標。但本研究未檢測CD4+CD25+Foxp3+Tre功能與其他抗結核免疫功能之間的關系，這有待進一步深入研究。

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The clinical significance of CD4+CD25+Foxp3+Treg expression and macrophage apoptosis in patients with tuberculosis﹡

Zhou An1,Xu Qiaoling2,Li Mingqiang1,Liu Qingmeng1△

(1.DepartmentofMicrobiology,ZunyiMedicalCollege，Zunyi，Guizhou563000，China；2.TuberculosisWardofGuizhouAerospaceHospital，Zunyi，Guizhou563000，China)

Objective To investigate the possible relationship between CD4+CD25+Foxp3+Treg expression and macrophage apoptosis in peripheral blood mononuclear cell(PBMC) in patients with tuberculosis and its clinical significance.Methods The expression of CD4+CD25+Foxp3+Treg before treatment and 3 and 6 months after treatment in PBMC and the apoptosis rate of monocytes in 29 patients with active tuberculosis and 17 patients with extrapulmonary tuberculosis were measured by flow cytometry,and the results were compared with those of 20 healthy controls(healthy control group).Results The proportion of CD4+CD25+Foxp3+Treg in PBMC of active tuberculosis patients was significantly higher than that of controls and treated patients (P<0.01),and the proportion of re-treatment patients was higher than that of primary treatment patients.The proportion of CD4+CD25+Foxp3+Treg in PBMC from the extra-pulmonary tuberculosis patients was higher than that of pulmonary tuberculosis patients(P<0.01).The apoptosis rate of monocytes of patients with tuberculosis was higher than that of the control group(P<0.01),and the apoptosis rate of primary treatment patients were higher than that of re-treatment patients(P<0.01).The expression of CD4+CD25+Foxp3+Treg in patients with active tuberculosis was negatively correlated with the apoptosis of macrophages in PBMC.Conclusion The expression of CD4+CD25+Foxp3+Treg is increased,and the apoptosis of macrophages is decreased,which might be related to chronic infection of tuberculosis.

active tuberculosis;peripheral blood mononuclear cell;CD4+CD25+Foxp3+Treg;macrophage apoptosis

貴州省衛生廳基金資助項目(D-166)。作者簡介：周安(1967-)，講師，碩士，主要從事抗感染免疫方面的研究。△

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1671-8348(2016)30-4217-03

2016-03-27

2016-07-15)