TLR基因多態性與結直腸癌易感性*

柴 利，黃 娟，陳 明，楊志惠

(西南醫科大學附屬醫院病理科，四川瀘州 646000)

?

論著·臨床研究 doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.30.012

TLR基因多態性與結直腸癌易感性*

柴 利，黃 娟，陳 明，楊志惠△

(西南醫科大學附屬醫院病理科，四川瀘州 646000)

目的 檢測Toll樣受體2(TLR2)R753Q和Toll樣受體4(TLR4)D299G、T399I多態性，分析其在結直腸癌發生、發展中的作用及機制。方法 收集結直腸癌患者及健康對照者各256例。R753Q、D299G和T399I位點基因型檢測采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)分析方法。結直腸癌組織中白細胞介素(IL)-1α、IL-8、巨噬細胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、單核細胞趨化因子-1(MCP-1)蛋白水平檢測采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。結果 TLR4 T399I與結直腸癌發病風險相關。CT合并TT基因型在病例組中頻率為31.2%，在對照組中僅為18.7%；T等位基因在病例組和對照組中頻率分別為18.2%和10.2%，差異有統計學意義(P<0.05)；T399I T等位基因個體患結直腸癌風險明顯增加(OR=2.534，95%CI:1.462～2.734,P<0.01)。不同基因型個體結直腸癌組織中IL-1α和MCP-1表達水平有明顯差異。CT合并TT基因型個體腫瘤組織中 IL-1α水平為(36.97±21.43)pg/mg，而CC基因型個體為(22.27±17.89)pg/mg；MCP-1水平在CT合并TT基因型個體中為(24.57±17.74)pg/mg，而CC基因型個體為(12.91±9.78)pg/mg。結論 TLR4 T399I與結直腸癌的發生、發展有關，T等位基因個體患結直腸癌的風險明顯增加，其機制可能是通過調控IL-1α和MCP-1在結直腸癌組織中的表達。

Toll樣受體；結直腸癌；多態性；細胞因子；趨化因子

Toll樣受體家族(Toll-like receptors，TLRs)是一個模式識別受體家族，目前已經被確認的人類TLR 有11個。來源不同的微生物，如細菌、病毒、原蟲和真菌的分子模式被TLR識別[1]。近年研究發現，不僅在人類免疫相關細胞上，在正常胃黏膜、腸黏膜、生殖道和呼吸道等上皮細胞中均有TLRs表達[2-5]。TLRs與慢性炎癥性疾病及腫瘤的發生、發展有關，但其分子機制尚不清楚[6-9]。本研究通過分析Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)R753Q，Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)D299G和T399I 基因型在結直腸癌病例-對照組中的分布，探討其與結直腸癌發病風險的相關性，并分析不同基因型個體結直腸癌組織中細胞因子和趨化因子蛋白的表達。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012～2014年本院胃腸外科及腫瘤科結直腸癌初診患者256例(病例組)，另外健康對照個體256例為本院同期健康體檢者(對照組)。所有研究對象均為無血緣關系的漢族個體，排除心、腦、腎及其他器官系統疾病。兩組性別、年齡、吸煙狀況等分布差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 基因型檢測 引物序列如下[10-11]：D299G： 5′-TTA GAA ATG AAG GAA ACT TGG AAA AG-3′和5′-TTT GTC AAA CAA TTA AAT AAG TGA TTA ATA-3′;T399I：5′-GGT TGC TGT TCT CAA AGT GAT TTT GGG AGA A-3′和 5′-CCT GAA GAC TGG AGA GTG AGT TAA ATG CT-3′;R753Q ：5′ -TAT GGT CCA GGA GCT GGA GA-3′ 和 5′ -TGA CAT AAA GAT CCC AAC TAG ACA A-3′。聚合酶鏈式反應(PCR)總反應體系均為25 μL，上游引物及下游引物均為0.4 μL，2×PCR 混合物12.5 μL，DNA模板2 μL，雙蒸水補足25 μL。反應條件：95 ℃ 4 min，94 ℃ 45 s，55 s(D299G：56 ℃，R753Q和T399I：58 ℃)，72 ℃延伸1 min，35個循環，最后72 ℃延伸10 min。采用Bio-Rad熱循環儀進行。各基因位點 PCR產物10 μL，分別經BsaBI，HinfI和SfcI 5 U 37 ℃過夜消化。酶切產物點樣于6%聚丙烯酰胺凝膠，600 V 1 h電泳，銀染顯色。

1.2.2 癌組織細胞因子及趨化因子蛋白濃度檢測 結直腸癌新鮮活體組織55份，T399I CT或TT基因型為一組，基因型CC為一組，分別為25、30份。腫瘤組織勻漿中白細胞介素(IL)-1α、巨噬細胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)、IL-8和單核細胞趨化因子-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)蛋白表達采用酶鏈免疫吸附試驗(ELISA)檢測。試劑盒由Invitrogen公司提供，檢測按試劑盒說明書操作。每份樣品檢測兩次，取均值。

2 結 果

2.1 TLR基因多態性與結直腸癌相關性分析 D299G、T399I和R753Q多態性位點基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。D299G和R753Q基因型及等位基因頻率分布無差異(結果未顯示)。CT合并TT基因型在病例組中頻率為31.2%，在對照組中僅為18.7%；T等位基金在病例組和對照組中頻率分別為18.2%和10.2%，差異有統計學意義(P<0.05)。T399I T等位基因的個體患結直腸癌風險明顯增加(OR=2.534，95%CI：1.462～2.734,P<0.01)，見表1。

2.2 TLR基因多態性與結直腸癌臨床病理參數分層分析 分層分析結果顯示，D299G、T399I和R753Q多態性在臨床Ⅰ+Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期中頻率分布差異無統計學意義(P>0.05)；在高、中、低分化腫瘤各組中的頻率分布差異亦無統計學意義(P>0.05)，見表2。且TLR基因多態性與性別、年齡、吸煙狀況等無交互作用(結果未顯示)。

2.3 TLR基因多態性與結直腸癌組織中細胞因子和趨化因子濃度相關性分析 IL-8和MIP-1α在T399I CT或TT基因型個體組及CC基因型個體組中的表達差異無統計學意義(P>0.05)。IL-1α在25例CT合并TT基因型個體中表達水平為(36.97±21.43)pg/mg，高于在30例CC基因型個體中的表達水平[(22.27±17.89)pg/mg]；MCP-1在CT合并TT基因型個體的表達水平[(24.57±17.74) pg/mg]亦高于CC基因型個體[(12.91±9.78)pg/mg]。IL-1α和MCP-1在T399I不同基因型中的表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，IL-1α和MCP-1濃度與個體基因型相關，見圖1。

表1 TLR 基因多態性基因型分布及與其結直腸癌相關性分析[n=256,n(%)]

*:性別和年齡校正OR和95%CI。

表2 TLR多態性與結直腸癌臨床病理參數分層分析[n(%)]

A:IL-1α表達水平比較;B:MCP-1表達水平比較。

圖1 不同基因型個體腫瘤組織中IL-1α 和MCP-1表達水平比較

3 討 論

結直腸癌是最常見的消化道系統惡性腫瘤，其發生與個人飲食、遺傳、環境等因素有關。而環境因素致癌最終取決于個人對腫瘤的易感性。本文探討了TLR2 R753Q和TLR4 D299G、T399I多態性與大腸腺癌的關系，探索該遺傳多態性位點在結直腸癌發生、發展中的作用及可能的機制，擬為結直腸癌的防控提供基礎科研依據。結果顯示，TLR4 T399I與結直腸癌的發病風險相關。T399I T等位基因的個體患結直腸癌患病風險明顯增加(OR=2.534，95%CI：1.462～2.734,P<0.01)。不同基因型個體結直腸癌組織中IL-1α和MCP-1表達有明顯差異。IL-1α和MCP-1在CT合并TT基因型個體的腫瘤組織中表達水平均明顯高于CC基因型個體組。

近年研究發現，腫瘤形成的主要原因之一是腫瘤細胞具有逃避宿主免疫系統識別及清除的能力。TLRs是參與非特異性免疫的一類重要分子，也是連接天然免疫和獲得性免疫系統的重要橋梁，在免疫系統中有著極為特殊的地位[12]。TLRs不僅能識別病原相關分子模式配體(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，還能識別并結合機體自身產生的熱休克蛋白、壞死細胞釋放的核苷酸和DNA等內源性分子即內源性配體，進行信號轉導，調節細胞因子的分泌而發揮生物學效應。TLRs主要表達在人類免疫相關細胞上，但在人類正常上皮及一些腫瘤細胞如宮頸癌、胃癌細胞中也發現高表達，并且與腫瘤生成、演變和侵襲進展有關[13-15]。

TLR4的配體是細菌脂多糖及其他腫瘤產物，結直腸中存在大量病原微生物，甚至有腫瘤細胞產物。TLR4可識別結直腸中的這些配體而啟動受體后信號傳導途徑，調節細胞因子和趨化因子的表達，改變腫瘤微環境，促進腫瘤逃避免疫監視，促進腫瘤的發展。本研究證實了TLR4可調節結直腸癌組織中IL-1α和MCP-1的表達，影響腫瘤的發生。而TLR4個體基因型不同，可影響其對配體的敏感性，從而個體患結直腸癌的風險亦有差異。

[1]Akira S，Uematsu S，Takeuchi O．Pathogen recognition and innate immunity[J]．Cell，2006，124(4)：783-801．

[2]Furrie E，Macfarlane S，Thomson G，et al．Toll-like receptors-2,-3 and -4 expression patterns on human colon and their regulation by mucosal-associated bacteria[J]．Immunology，2005，115(4)：565-574．

[3]Schmausser B，Andrulis M，Endrich S，et al．Expression and subcellular distribution of toll-like receptors TLR4,TLR5 and TLR9 on the gastric epithelium in Helicobacter pylori infection[J]．Clin Exp Immunol，2004，136(3)：521-526．

[4]Huhta H，Helminen O，Kauppila JH，et al．The expression of Toll-like receptors in normal human and murine gastrointestinal organs and the effect of microbiome and cancer [J]．J Histochem Cytochem，2016，64(8)：470-482．

[5]Liu W，Chen M，Li X，et al．Interaction of Toll-like receptors with the molecular chaperone Gp96 is essential for Its activation of cytotoxic T lymphocyte response[J]．PLoS One，2016，11(5)：e0155202．

[6]Chuang HC，Huang CC，Chien CY，et al．Toll-like receptor 3-mediated tumor invasion in head and neck cancer[J]．Oral Oncol，2012，48(3)：226-232．

[7]曾紅梅，潘凱楓，張陽，等．ToⅡ樣受體2及ToU樣受體9基因多態性與胃癌易感性的關系[J]．中華預防醫學雜志，2011，45(7)：588-592．

[8]陳曉，王啟之，梁冰，等．Toll 樣受體4、腫瘤壞死因子-α 在潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織中的表達及意義[J]．蚌埠醫學院學報，2013，38(2)：134-136．

[9]Schwartz AL，Dickerson E，Dagia N，et al．TLR signaling inhibitor,phenylmethimazole,in combination with tamoxifen inhibits human breast cancer cell viability and migration[J/OL]．Oncotarget，2016[2016-09-28].http://www.impactjournals.com/oncotarget/index.php?journal=oncotarget&page=article&op=view&path%5B%5D=10358.doi: 10.18632/oncotarget.10358.

[10]Rigoli L，Di Bella C，Fedele F，et al．TLR4 and NOD2/CARD15 genetic polymorphisms and their possible role in gastric carcinogenesis[J]．Anticancer Res，2010，30(2)：513-517．

[11]Speletas M，Kalala F，Mitroulis I，et al．TLR2 and TLR4 polymorphisms in familial Mediterranean fever[J]．Hum Immunol，2009，70(9)：750-753．

[12]Medzhitov R，Preston-Hurlburt P，Janeway CA Jr．A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity[J]．Nature，1997，388(6640)：394-397．

[13]Chen R，Alvero AB，Silasi DA，et al．Cancers take their Toll-the function and regulation of Toll-like receptors in cancer cells[J]．Oncogene，2008，27(2)：225-233．

[14]Li W，Xiao J，Zhou X，et al．STK4 regulates TLR pathways and protects against chronic inflammation-related hepatocellular carcinoma[J]．J Clin Invest，2015，125(11)：4239-4254．

[15]Dong T，Yi T，Yang M，et al．Co-operation of α-galactosylceramide-loaded tumour cells and TLR9 agonists induce potent anti-tumour responses in a murine colon cancer model[J]．Biochem J，2016，473(1)：7-19．

The correlation of genetic polymorphism of Toll-like receptor with susceptibility of colorectal carcinoma*

Chai Li，Huang Juan,Chen Ming，Yang Zhihui△

(DepartmentofPathology,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To detect genetic polymorphism of Toll like receptor 2(TLR2) R753Q and Toll like receptor 4(TLR4) D299G and T399I,and to analyze its role and mechanism in the occurrence and development of colorectal carcinoma.Methods Totally 256 cases of patients with colorectal carcinoma and 256 cases of healthy control individuals were collected.The genotypes of TLR2 R753Q,TLR4 D299G and TLR4 T399I were detected by using PCR-RFLP method.The levels of IL-1α,IL-8,MIP-1α and MCP-1 protein were detected by using ELISA.Results It is shown that TLR4 T399I was associated with the risk of colorectal cancer.The frequency of CT combined TT genotype of T399I in case group and control group was 31.2% and 18.7%,respectively.The frequency of T allele in case group and control group was 18.2% and 10.2%,respectively,and difference was statistically significant(P<0.05).Individuals with T allele of T399I showed a 2.534-fold increase in colorectal cancer risk compared with the T399I C allele(95%CI:1.462-2.734,P<0.01).There were significant differences in the expression levels of IL-1α and MCP-1 in colorectal carcinoma tissues of different genotypes.The expression level of IL-1α in patients with CT combined TT genotype of T399I and those with CC genotype was (36.97±21.43) and (22.27±17.89)pg/mg respectively,and the expression level of MCP-1 was (24.57±17.74) and (12.91±9.78)pg/mg respectively.Conclusion T399I TLR4 is associated with the occurrence and development of colorectal carcinoma,and the risk of colorectal carcinoma in individuals with T genotype is significantly increased,in which monitoring the expression of IL-1 and MCP-1 in colorectal carcinoma tissues might be the mechanism.

Toll like receptor;colorectal cancer;polymorphism;cytokine;chemokine

國家自然科學基金資助項目(81101679)；四川省科技廳基金資助項目(14JC0091)；四川省瀘州市基金資助項目(2013LZLY-J44)。 作者簡介：柴利(1970-)，技師，大專，主要從事消化道腫瘤病理學研究。△

R363.2+5

A

1671-8348(2016)30-4214-03

2016-03-03

2016-06-16)