甘草酸苷通過NF-κB通路影響小鼠急性肝損傷機制的研究*

邱惠萍，李小六，饒和平

(1.衢州職業技術學院醫學院內科教研室，浙江衢州 324000；2.蚌埠醫學院第一附屬醫院藥劑科，安徽蚌埠 236000)

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論著·基礎研究 doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.30.011

甘草酸苷通過NF-κB通路影響小鼠急性肝損傷機制的研究*

邱惠萍1，李小六2，饒和平1

(1.衢州職業技術學院醫學院內科教研室，浙江衢州 324000；2.蚌埠醫學院第一附屬醫院藥劑科，安徽蚌埠 236000)

目的 探討甘草酸苷是否可通過調控核因子-κB(NF-κB)通路影響小鼠急性肝損傷。方法 選取200只體質量29～30 g昆明小鼠，分為4組，每組50只。第1組為對照組；第2組由四氯化碳(CCl4)誘導急性肝損傷；第3組在第2組的基礎上注射復方甘草酸苷(SNMC)注射液；第4組在第3組的基礎上加用NF-κB抑制劑(proDTC)。處理1、3、5 d后，檢測小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽紅素、清蛋白水平及凝血酶原時間(PT)，計算Child-Pugh評分并進行病理學觀察。結果 相較于第1組，CCL4處理后，AST、ALT、總膽紅素、清蛋白表達水平，以及PT和Child-Pugh肝功評分均明顯升高(P<0.05)，表明已成功建立CCL4誘導急性肝損傷模型。同時給予小鼠SNMT后(CCL4+SNMT)，各指標表達雖未回至正常水平，但隨著處理時間的延長，表達水平逐漸降低(P<0.05)。同時此效應可被NF-κB抑制劑proDTC逆轉。結論 SNMT可通過調節NF-κB通路降低小鼠急性肝損傷的嚴重程度。

復方甘草酸苷；核因子-κB；急性肝損傷

急性肝損傷是臨床上常見的一類重癥肝損傷,其可由酒精、化學藥物、有機化合物及病毒感染等多種因素導致[1]。臨床上常表現為肝臟短期內出現大片壞死及肝功能急劇衰竭，是導致患者死亡的重要原因之一[2-3]。因此，深入探究急性肝損傷的發生機制，靶向扼制損傷發展及尋找合理逆轉急性肝損傷的藥物具有重要的社會醫學價值。甘草酸苷是從中藥甘草中提煉出的，一種具有降低肝損傷、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、肝細胞脂肪變形及肝纖維化等一系列保肝功效的藥物，是糖尿病及肝病患者的常用護肝藥之一[4-5]。近年來研究，復方甘草酸苷(SNMC)合并舒肝寧治療急性肝損傷具有顯著的療效[6]，提示甘草酸苷可影響機體急性肝損傷的修復[5]。然而其具體機制還不明了。目前，大量研究顯示，核因子-κB(NF-κB)通路在各種因素導致的急性肝損傷過程中扮演了重要的角色[7]。并且高表達NF-κB，可顯明顯降低小鼠急性肝損傷的程度[8-9]。因此，本文聚焦于甘草酸苷促進肝損傷修復的臨床現象及NF-κB通路在急性肝損傷過程中扮演的重要角色，以探究甘草酸苷影響小鼠急性肝損傷的具體機制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗中選取的200只昆明小鼠(體質量為29～30 g)，均購自廣州醫科大學動物實驗中心。SNMC注射液購自華北制藥股份有限公司、四氯化碳(CCl4)及NF-κB抑制劑(proDTC)均購自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物處理 選取200只體質量為29～30 g的昆明小鼠，分為4組，各50只。第1組為對照組，腹腔注射生理鹽水20 μL/10 g；第2組腹腔注射0.5%的CCl420 μL/10 g誘導急性肝損傷；第3組在第2組的基礎上注射臨床SNMC注射液(最大劑量3.3 μL/10 g)；第4組在第3組的基礎上加用NF-κB抑制劑(proDTC)150 μL/10 g。均連續注射5 d。

表1 各組不同指標水平比較

1.2.2 實驗指標檢測 分別在1、3、5 d于小鼠尾靜脈抽取外周血，采用小鼠血清標本試劑盒(碧云天)檢測天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、ALT、總膽紅素、清蛋白的表達水平及凝血酶原時間(PT)。同時按Child-Pugh評分量表對小鼠肝功進行評分[10]。5 d后，取小鼠肝臟組織切片，光鏡下觀察肝臟病理變化。

A：各組AST表達水平變化；B：各組ALT表達水平變化；C：各組Child-Pugh評分變化；D：光鏡下觀察處理5 d后小鼠肝臟病理切片(蘇木精-伊紅染色，×200；Ⅰ：第1組;Ⅱ:第2組;Ⅲ:第3組;Ⅳ:第4組)：n=5；*：P<0.05；**：P<0.01。

圖1 各組不同指標表達水平及病理變化

2 結 果

通過比較4組經不同試劑處理小鼠外周血AST與ALT的表達水平，結果顯示，相較于第1組(對照組),第2組CCL4處理后，ALT與AST表達水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，表明已成功建立CCL4誘導急性肝損傷模型。同時給予小鼠SNMC后(CCL4+SNMC)，AST及ALT表達雖未恢復至正常水平，但隨著處理時間的延長，表達水平逐漸降低，見表1。同時，給予NF-κB抑制劑proDTC(CCL4+SNMC+proDTC)后可逆轉該效應(圖1A、B)。此外，根據最新指南Child-Pugh肝功評分量表，結果顯示在4組實驗中，Child-Pugh評分變化趨勢與ALT(AST)變化趨勢一致(圖1C)；并且光鏡下觀察病理切片結果顯示，CCL4處理后，肝細胞發生明顯壞死、細胞空泡變性及脂肪變性；而加入SNMC后，壞死比例明顯下降，同時細胞空泡變性及脂肪變性也明顯減少。同樣此效應可被proDTC逆轉(圖1D)。

3 討 論

急性肝損傷是臨床上消化科的一類常見急癥[1]。其發展迅速，在很短時間導致患者大片肝壞死，肝功能急劇下降，繼而引起一系列全身多系統并發癥，最后導致患者死亡[11]。雖然，目前免疫抑制劑的廣泛應用極大地降低了患者急性肝損傷的嚴重程度，但其效果還并不理想[12-13]。因此，通過探究患者急性肝損傷的發病機制，有針對性地阻斷對肝細胞的毒害作用，并促進自體肝細胞的再生與修復，非常有助于臨床急性肝損傷的治療，具有重要的醫學價值。目前研究認為，無論是在何種因素所致急性肝損傷的環節中，NF-κB信號通路均扮演了重要的角色。重癥肝炎及肝衰竭中NF-κB信號的表達明顯低于正常或輕度肝損傷患者[14]。特異性增強肝細胞內NF-κB信號的表達可提高肝細胞耐受缺氧等多種應激的能力，并促進肝細胞的再生與修復[9]。以上研究提示，深入探究NF-κB信號在肝損傷過程中扮演的重要角色，有助于更好地阻斷并逆轉肝損傷。

因此，本研究以CCL4誘導肝損傷構建急性肝損傷模型，采用NF-κB信號通路抑制劑proDTC，觀察加入proDTC前后SNMC對小鼠急性肝損傷的影響。結果顯示，SNMC可明顯降低CCL4誘導的急性肝損傷的嚴重程度；而proDTC的加入可抑制SNMC的作用，促進小鼠急性肝損傷的發生。因此，以上研究提示，SNMC可通過調節NF-κB信號通路降低急性肝損傷的嚴重程度。本研究通過檢測不同肝功指標，觀察加入proDTC前后SNMC對小鼠急性肝損傷的影響。然而，由于SNMC對肝細胞的影響是多方面的，不僅僅可降低肝損傷程度，同時與肝纖維化、細胞凋亡壞死、脂肪肝及水樣變性等密切相關[4,15]。提示一方面NF-κB信號通路不僅參與了SNMC的抗損傷作用；同時NF-κB通路可能只是SNMC抗肝損傷機制的一小部分，很可能還存在其他的機制。本研究以SNMC抗肝損傷為媒介，深入探討急性肝損傷的發生、發展機制，從而更好地控制急性肝損傷，為臨床用藥提供更多的理論指導。

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Study on the mechanism of SNMT on acute liver injury in mice by NF-κB signaling pathway﹡

Qiu Huiping1，Li Xiaoliu2，Rao Heping1

(1.DepartmentofInternalMedicine,MedicalSchoolofQuzhouCollegeofTechnology,Quzhou,Zhejiang324000,China；2.DepartmentofPharmacy,theFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu,Anhui236000,China)

Objective To explore whether glycyrrhizin has protective effect on acute liver injury in mice by NF-κB signaling pathway.Methods Totally 200 Kunming mice which the body weight were about 29-30 g were chose and divided into 4 groups randomly,50 cases in each group.The first group was the control group;the second group was acute liver injury group induced by CCl4;the third group was injected with Stronger Neo-Minophagen C(SNMC) injection on the basis of second groups;the fourth group was treated with NF-κB inhibitor (proDTC) on the basis of the third group.After 1,3,5 d treatment,the serum expressing levels of ALT,AST,total bilirubin,albumin of mice and prothrombin time were detected,the Child-Pugh score was calculated,and the pathological observation was performed.Results The results showed that,compared to the first group,after CCl4treatment,the expressing levels of AST,ALT,total bilirubin and albumin,the PT and Child Pugh score all were significantly increased(P<0.05),which indicated that the acute liver injury model induced by CCl4was successfully established.After the treatment of SNMT(CCl4+SNMT) in mice,although the level of each index did not return to normal level,with the extension of treatment time,the level of each index was also significantly reduced (P<0.05).At the same time,this effect could be reversed by NF-κB inhibitor proDTC.Conclusion SNMT plays a significantly protective role in acute liver injury via regulating NF-κB signaling pathway.

SNMT；nuclear factor-κB；acute liver injury

浙江省公益技術應用研究項目(2014C33252)。 作者簡介：邱惠萍(1971-)，副教授，本科，主要從事感染病學教學與研究。

R285.5

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1671-8348(2016)30-4211-03

2016-03-23

2016-07-11)