H2型松弛素促進人血管平滑肌細胞遷移的作用及機制

馬曉娟，王 俠，丁肖華，付毓平

(新鄉醫學院三全學院檢驗與影像學院，河南新鄉 453003)

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H2型松弛素促進人血管平滑肌細胞遷移的作用及機制

馬曉娟，王 俠，丁肖華，付毓平

(新鄉醫學院三全學院檢驗與影像學院，河南新鄉 453003)

目的 探討H2型松弛素(Relaxin-2)對血管平滑肌細胞(VSMCs)遷移的作用及分子機制。方法 采用劃痕實驗和Transwell實驗檢測Relaxin-2對VSMCs的遷移作用；采用蛋白質印跡法檢測其對細胞信號蛋白絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(Akt)、細胞外信號調節激酶(ERK)、核因子-κB(NF-κB) p65的影響。結果 Relaxin-2可劑量依賴性促進VSMCs的遷移，應用NF-κB抑制劑BAY 11-7082可阻斷Relaxin-2誘導的基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)和基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)的表達，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制劑LY294002 和ERK抑制劑 U0126預處理可以降低Relaxin-2引起的NF-κB p65的激活。結論 Relaxin-2可能通過活化PI3K/Akt和ERK信號通路激活NF-κB p65，進而促進MMP-9和MMP-2的表達，從而誘導VSMCs遷移效應。

H2型松弛素；血管平滑肌細胞；遷移

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)在維持血管穩態中發揮重要作用。當血管受到損傷或外界刺激時可引起VSMCs的增殖和遷移，VSMCs遷移至內膜引起的內膜增生是血管外科搭橋術、經皮血管成形術、血管移植術等手術后血管再狹窄發生的重要因素[1]。外界因素主要包括細胞因子、趨化因子、生長因子及基質金屬蛋白酶(matrix Metalloproteinases，MMPs)等，均可引起VSMCs的遷移。正常的VSMCs位于血管中膜層，周圍由細胞外基質包裹，阻止VSMCs的遷移[2]。MMPs表達異常時可引起細胞外基質的降解，從而使VSMCs失去控制，獲得遷移能力，MMPs表達異常引起的VSMCs遷移在動脈粥樣發病中起重要作用。其中基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)和基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)是MMPs家族中的兩個重要成員，在VSMCs遷移中起關鍵作用[3]。核因子-κB(NF-κB)是參與炎癥的重要轉錄因子，NF-κB也是參與MMP-2和MMP-9蛋白表達的重要調控因子[4]。研究發現，磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)和細胞外信號調節激酶(ERK)信號通路在NF-κB激活中發揮重要作用[5]。松弛素一直作為一種孕激素為人們所了解，H2型松弛素(Relaxin-2)是其中一種亞型，是機體循環中最主要的成分之一。過去研究表明，松弛素具有抗纖維化、治療心衰、改善心肌缺血再灌損傷、降低血壓等心血管保護作用[6]。但近年來發現，松弛素具有促進細胞遷移的效應，且有研究發現人骨肉瘤組織和骨肉瘤患者血清中的Relaxin-2水平呈不同程度的增加，其中，晚期骨肉瘤患者和血行轉移癌患者血清Relaxin-2水平更高，體外實驗表明下調Relaxin-2可以抑制MG-63骨肉瘤細胞的遷移和血管生成等生物學效應[7]。此外，Relaxin-2具有促進MMP-2和MMP-9表達的效應[8]，提示Relaxin-2可能在VSMCs的遷移中發揮作用，松弛素可以激活NF-κB p65信號通路減弱內皮素誘導的血管收縮，還有研究發現Relaxin-2通過激活PI3K/Akt和ERK參與纖維軟骨細胞MMP-9的產生，但目前并沒有松弛素對VSMCs遷移效應的報道。本研究旨在探討松弛素對VSMCs遷移的效應，以及確定松弛素是否可以通過PI3K/Akt、ERK和NF-κB上調MMP-2 和MMP-9進而引起VSMCs的遷移效應，為治療血管再狹窄和動脈粥樣硬化等疾病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人的VSMCs系購自美國ATCC公司，Relaxin 2 (Human)購自美國Phoenix Biotech公司，Dulbecco氏改良Eagle培養基/F-12(DMEM/F-12)培養基、胎牛血清和胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，青霉素、鏈霉素和二甲基亞砜(DMSO)均購自美國Sigma公司，Akt兔多克隆抗體及其磷酸化抗體、ERK1/2兔多克隆抗體及其磷酸化抗體和內參三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)兔多克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司，NF-κB p65兔多克隆抗體、MMP-9兔多克隆抗體和MMP-2兔多克隆抗體均購自美國Proteintech公司。放射免疫沉淀分析(RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、5×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(5×SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液、彩色預染蛋白質相對分子質量標準、細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒、BeyoECL Plus超敏電化學發光(ECL)試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法。

1.2.1 VSMCs培養 采用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養基培養人VSMCs，37 ℃ 5%二氧化碳(CO2)培養，每2天換1次液，待細胞生長至密度為70%～80%時，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3或1∶4進行傳代，取對數生長期細胞用于實驗。以未用Relaxin-2處理的VSMCs作為對照。

1.2.2 細胞劃痕實驗 通過劃痕實驗來檢測Relaxin-2對人VSMCs的遷移能力，胰酶消化對數生長期VSMCs，以每孔1×104個細胞接種于24孔板內，待細胞生長到單層融合狀態時，用200 μL移液器槍頭在培養板底部進行劃痕，劃痕呈“一”字，無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕洗去懸浮的細胞，加入無血清的培養基，在5% CO2和37 ℃恒溫條件下孵箱繼續培養24 h，在相同位置和相同放大倍數下觀察并照相，測量細胞的相對遷移距離。

1.2.3 Transwell實驗 通過Transwell實驗來檢測Relaxin-2對人VSMCs的遷移能力，取對數生長期的VSMCs，將濃度每孔1×104個細胞的無血清細胞懸液接種到Transwel小室上室，向Transwel小室下室加入含不同濃度Relaxin-2(10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)的無血清培養基在5% CO237 ℃恒溫孵箱中繼續培養24 h，使細胞遷移至基底膜下，取出小室，用棉簽拭去上室表面未遷移過去的細胞，用甲醇固定20 min，風干，1%結晶紫染色5 min，將培養小室倒置，在光學顯微鏡下觀察、照相，并每組隨機選取5個視野，計數每低倍視野濾膜底面的平均細胞數。

1.2.4 蛋白質印跡法(Western blotting)檢測蛋白的表達 采用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，冰上裂解30 min，4 ℃低溫離心機12 000 r/min離心10 min，收集上清液，BCA法測定細胞蛋白濃度，加入適量的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴加熱5 min使蛋白充分變性保存備用，用微量加樣器將等量的蛋白加入到上樣孔中，經SDS-PAGE分離蛋白后，將蛋白電轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%的脫脂牛奶封閉1 h，1×TBST清洗3次，每次10 min，加入合適濃度的一抗，4 ℃ 緩慢搖動過夜，第2天取出PVDF膜，1×TBST清洗3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的合適二抗，室溫孵育1 h，1×TBST清洗3次，每次10 min，加入超敏ECL發光液，發光儀檢測抗體結合條帶。

1.2.5 細胞核蛋白和細胞質蛋白的分離 根據生產廠家提供的提取步驟，在低滲透壓條件下，使細胞充分膨脹，然后破壞細胞膜，釋放出細胞質蛋白，然后通過離心得到細胞核沉淀。最后通過高鹽的細胞核蛋白抽提試劑抽提得到細胞核蛋白和細胞質蛋白。細胞質蛋白以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參，細胞核蛋白以Lamine為內參。

1.2.6 細胞免疫熒光 將對數生長期的細胞分別給予無菌PBS和10-5mol/L的Relaxin-2刺激24 h后，PBS清洗1次，4%多聚甲醛固定30 min，滴加0.1% Triton X-100室溫孵育10 min，0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min，滴加即用型正常山羊血清，置于濕盒中37 ℃孵育1 h，棄去血清，勿洗，加入合適濃度的NF-κB p65抗體(1∶200)，4 ℃冰箱過夜。棄去一抗，PBS沖洗3次，每次5 min，加入合適濃度的異硫氰酸熒光素標記的猴抗羊抗體IgG(FITC-conjugated monkey anti-goat IgG，1∶200)，置入暗盒中30 min，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色5 min，滴加防熒光猝滅劑，封片，暗盒內風干熒光顯微鏡下觀察。

2 結 果

2.1 Relaxin-2促進VSMCs的遷移 細胞劃痕實驗和Transwell實驗證明Relaxin-2可劑量依賴性(10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)促進VSMCs的遷移，與對照組相比，Relaxin-2明顯增加VSMCs的遷移距離和穿透數目(P<0.05)，見圖1、表1。因此本研究選擇10-5 mol/L的Relaxin-2做下一步研究。

2.2 Relaxin-2促進MMP-9和MMP-2的表達 Western blotting實驗結果表明Relaxin-2可促進MMP-9和MMP-2的表達，Relaxin-2處理VSMCs 12 h即可引起MMP-9和MMP-2的表達增加，24 h效果更加明顯(P<0.05)，見圖2。

2.3 NF-κB p65參與Relaxin-2誘導的MMP-9和MMP-2的表達 為了研究Relaxin-2可促進MMP-9和MMP-2表達的機制，進一步研究發現Relaxin-2可引起NF-κB p65的核移位，表現為細胞質的NF-κB p65水平下降(P<0.05，圖3B)，但細胞核內的NF-κB p65水平明顯升高(P<0.05，圖3A)，提示Relaxin-2可引起NF-κB p65的激活，細胞免疫熒光進一步證實Relaxin-2促進NF-κB p65的核移位(圖4)。應用NF-κB抑制劑BAY 11-7082可阻斷Relaxin-2誘導的MMP-9和MMP-2的表達(圖5)。

2.4 PI3K/Akt和ERK信號通路Relaxin-2的NF-κB p65激活 為了研究Relaxin-2可促進NF-κB p65激活的機制，進一步研究發現Relaxin-2可促進Akt和ERK1/2的磷酸化(P<0.05，圖6)，應用PI3K抑制劑LY294002 和ERK抑制劑 U0126預處理可以降低Relaxin-2引起的NF-κB p65核移位，提示PI3K/Akt和ERK信號通路參與了Relaxin-2誘導的NF-κB p65激活(圖7)。

表1 不同水平Relaxin-2處理人VSMCs系24 h后細胞遷移情況

*:P<0.05，與對照組比較。

A～E：劃痕實驗，不同水平Relaxin-2(10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)處理人VSMCs系24 h后細胞遷移情況；a～e:Transwell實驗，不同水平Relaxin-2(10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)處理人VSMCs系24 h后細胞遷移情況。

圖1 Relaxin-2促進VSMCs的遷移(×100)

*：P<0.05，與0 h組比較。

圖2 Relaxin-2促進MMP-9和MMP-2的表達

A:細胞核；B:細胞質；*：P<0.05，與0 h組比較； Lamine：細胞核蛋白內參；GAPDH：細胞質蛋白內參。

圖3 Relaxin-2對NFκB-p65的影響

圖4 細胞免疫熒光顯示Relaxin-2促進NFκB-p65的核移位(×400)

*:P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與對照+Relaxin-2組比較；BAY 11-7082：NF-κB抑制劑。

圖5 NF-κB p65參與Relaxin-2誘導的MMP-9和MMP-2的表達

*：P<0.05，與0 h比較。

圖6 Relaxin-2對Akt和ERK1/2磷酸化水平的影響

*:P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與對照+Relaxin-2組比較。

圖7 Akt和ERK信號通路對Relaxin-2誘導的NF-κB p65核移位的影響

3 討 論

當受到外界刺激或疾病狀態下，靜止的VSMCs獲得遷移能力，VSMCs的遷移是動脈粥樣硬化斑塊形成和血管成形術后再狹窄等心血管疾病的共同病理特征。抑制VSMCs過度遷移的關鍵靶點成為治療血管再狹窄和動脈粥樣硬化等疾病的重要策略之一。本研究發現，Relaxin-2可通過激活PI3K/Akt和ERK等關鍵細胞通路促進NF-κB p65轉錄因子的核移位，上調MMP-9和MMP-2的表達，促進細胞外基質的降解，引起VSMCs遷移效應。

研究發現，松弛素還可促進乳腺癌細胞的侵襲能力，這些結果表明松弛素可能具有促進細胞遷移的能力[8]。正常機體情況下，VSMCs處于分化狀態，不具有遷移能力，但當血管受損或在機械刺激等因素作用下，VSMCs即可獲得遷移能力，VSMCs的遷移參與了動脈粥樣硬化、血管成形術術后再狹窄等心血管疾病的發生、發展。但目前并沒有相關研究證實松弛素對VSMCs遷移是否有影響，本研究通過細胞劃痕實驗和Transwell實驗初步證實Relaxin-2具有促進VSMCs遷移的作用。

MMPs是一類鋅蛋白酶，在動脈粥樣硬化和血管損傷時可促進細胞外基質的降解，正常情況下，VSMCs被細胞外基質包裹，起到阻止VSMCs遷移的作用。在血管損傷等情況下，MMPs表達會發生異常增加，通過降解細胞外基質來促進VSMCs的遷移。MMP-2和MMP-9是MMPs家族的重要成員，研究表明，其表達增加參與了血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)和葡萄糖誘導的VSMCs的遷移[8]，在球囊損傷引起的血管內膜增生模型中，二者表達均出現上調現象[9]，且松弛素可引起心肌細胞產生MMP-2和MMP-9，從而參與心肌細胞外基質的重構[7]。研究還發現，用Relaxin-2處理人皮膚成纖維細胞，也可促進MMP-2和MMP-9的表達，進而抑制膠原沉積和肌成纖維細胞的異常分化[6]。本研究發現，Relaxin-2可促進MMP-9和MMP-2的表達，Relaxin-2處理VSMCs可引起MMP-9和MMP-2的表達增加，結果表明，MMP-9和MMP-2表達上調可能參與了Relaxin-2引起的VSMCs的遷移。

NF-κB是參與炎癥的重要轉錄因子，NF-κB激活參與了VSMCs的遷移效應和血管損傷引起的內膜損傷，此外研究還表明NF-κB是MMP-2和MMP-9蛋白表達的重要調控因子。另有研究表明，松弛素可以激活NF-κB信號通路促使人單核細胞系THP-1分泌MMP-9[10]。阻斷NF-κB信號通路可抑制Relaxin-2引起的前列腺癌細胞株的過度增殖[9]。松弛素可以激活NF-κB p65信號通路減弱內皮素誘導的血管收縮。本研究發現，Relaxin-2可引起NF-κB p65的核移位，表現為細胞質的NF-κB p65水平下降，但細胞核內的NF-κB p65水平明顯升高，提示Relaxin-2可引起NF-κB p65的激活，應用NF-κB抑制劑BAY 11-7082可阻斷Relaxin-2誘導的MMP-9和MMP-2的表達。結果表明，Relaxin-2可通過NF-κB p65信號通路參與MMP-9和MMP-2的表達，進而促進VSMCs的遷移。PI3K/Akt和ERK等信號通路參與了VSMCs的遷移效應，且PI3K/Akt和ERK等信號通路的激活是促進NF-κB p65活化的重要因素[11]。研究發現，Relaxin-2可通過激活Akt/糖原合成酶激酶3β(GSK3β)信號通路促進人類絨毛外滋養細胞的增殖，還可通過激活Akt/血管內皮生長因子(VEGF)信號通路、MMP-9的表達參與人骨肉瘤細胞的生物學效應[12-13]。還有研究發現，Relaxin-2通過激活PI3K/Akt和ERK參與纖維軟骨細胞MMP-9的產生[14]。本研究發現，Relaxin-2可促進Akt和ERK1/2的磷酸化，應用PI3K抑制劑LY294002 和ERK抑制劑 U0126預處理可以降低RLN-2引起的NF-κB p65的激活，提示PI3K/Akt和ERK信號通路參與了Relaxin-2誘導的NF-κB p65的激活。

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Role of Relaxin-2 in the migration of human vascular smooth muscle cells and its underlying mechanisms

Ma Xiaojuan，Wang Xia，Ding Xiaohua，Fu Yuping

(DepartmentofInspectionandImage,SanquanCollegeofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453003,China)

Objective To investigate the effect and the associated mechanism of Relaxin-2 in the migration of human vascular smooth muscle cells (VSMCs).Methods The migration of VSMCs in responsing to Relaxin-2 was evaluated by using wound healing assay and transwell assay,and the cell signaling proteins,including Akt,ERK and NF-κB p65,in responsing to Relaxin-2 were measured by using Western blotting assay.Results Relaxin-2 can promote the migration of VSMCs in a dose-dependent manner,NF-κB inhibitor BAY11-7082 can block the expression of MMP-9 and MMP-2 induced by Relaxin-2,pretreatment with PI3K inhibitor LY294002 and ERK inhibitor U0126 can reduce the activation of NF-κB p65 induced by Relaxin-2.Conclusion NF-κB p65 could be activated by the activation of PI3K/Akt and ERK signaling pathway induced by Relaxin-2,thereby promoting the expression of MMP-9 and MMP-2,and inducing VSMCs migration effect.

Relaxin-2；vascular smooth muscle cells； migration

馬曉娟(1987-)，助教，碩士，主要從事分子生物學研究。

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.30.010

R329.2

A

1671-8348(2016)30-4207-04

2016-04-11

2016-07-09)