間歇性低氧致樹突狀細胞遷徙能力改變及其通路機制探討*

胡 柯,王光偉△,楊 宇，徐國耀，李玉嫻

(1.湖南醫藥學院臨床醫學院，湖南懷化 418000；2.中南大學湘雅二醫院老年病科，長沙 410013)

?

論著·基礎研究 doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.30.008

間歇性低氧致樹突狀細胞遷徙能力改變及其通路機制探討*

胡 柯1,王光偉1△,楊 宇2，徐國耀1，李玉嫻1

(1.湖南醫藥學院臨床醫學院，湖南懷化 418000；2.中南大學湘雅二醫院老年病科，長沙 410013)

目的 通過模擬人阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSAS)間歇性低氧(IH)環境，觀察其對人外周血來源樹突狀細胞(DCs)遷徙能力的影響，并通過干預RelB、p38的表達探討IH致DCs遷徙能力改變的可能通路機制。方法 培養前將DCs分為RelB、p38干擾及非干擾質粒組。利用間歇低氧艙設置低氧環境，其中，給氧濃度為0.5%、1.5%、5.0%、10.0%，低氧/再氧合時間比為1∶1、1∶3、1∶5、1∶9，常氧對照組予以持續21.0%氧濃度供應。體外培養結束后蛋白質印跡法檢測RelB、p38的表達，侵襲小室檢測DCs的遷徙能力。結果 相對于常氧，體外IH下DCs整體遷徙能力下降，且DCs遷徙能力與IH環境下平均氧分壓水平呈正相關(r=0.867，P<0.05)，IH可促進DCs胞內RelB、p38表達，而干預二者表達均未逆轉IH下遷徙能力的改變。結論 體外IH可導致DCs遷徙能力下降，且可能與RelB、p38激活無關。

間歇性低氧；樹突狀細胞；遷徙能力；RelB；p38

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnea syndrome，OSAS)的間歇性低氧(intermittent hypoxia，IH)往往刺激體內炎癥及氧化應激，造成動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)等血管并發癥的發生、發展。樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)作為體內最重要的抗原提呈細胞，很可能參與了OSAS致AS的過程。近來有研究報道，較之常氧，IH下DCs成熟表型及白細胞介素(IL)-12分泌增加，刺激T淋巴細胞反應(MLR)增強，并可能與細胞內活性氧(ROS)/Toll樣受體4(TLR4)/ RelB,p38通路激活關聯密切[1-2]。也有研究推斷，DCs致AS的發生、發展除了需要分化成熟及具備免疫調節功能，還必須具備一定的遷徙能力，這樣才能定植于血管內皮或歸巢淋巴結，激活淋巴單核巨噬系統，促進泡沫細胞及粥樣斑塊形成。而國內有研究報道，持續低氧下DCs的遷徙能力明顯下降[3]，提示有必要明確IH對DCs遷徙能力的影響規律及其通路機制，以進一步闡明DCs在OSAS血管并發癥中可能起到的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 胎牛血清，重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)，重組人白細胞介素-4(rhlL-4)，淋巴細胞分離液，RPMI-1640，重組人RANTES(rhRANTES)，基質膠(matrigel)，考馬斯亮藍G-250，牛血清清蛋白(BSA)等均為國產；p38及RelB一抗，電化學發光(ECL)顯色試劑盒，免疫磁珠，過濾柱及Boy-den小室均購自美國Millipore公司；RelB-Snail及p38-pGenesil干擾質粒為武漢晶賽生物工程技術有限公司構建。

1.2 方法

1.2.1 IH環境設置 由湖南省老年病學研究室提供整套設備，包括氣源與程控系統，分別決定低氧程度及不同時間比的低氧/再氧合循環。低氧→再氧合→低氧→再氧合模式循環，設置給氧濃度為0.5%、1.5%、5.0%、10.0%，低氧/再氧合(IH/ROX)時間比為1∶1、1∶3、1∶5、1∶9，共計400個循環，計時240 min后，繼續在常氧(5% CO2，21% O2)條件下培養240 min。常氧培養組(持續21.0%給氧濃度)作對照，常氧下維持培養480 min。

1.2.2 人外周血來源的DCs的獲取 健康志愿者抗凝外周血來自長沙市血液中心，采用梯度密度離心(Ficoll)獲得單個核細胞。免疫磁珠陰性篩選法去除CD3、CD14、CD19和CD56細胞，再陽性篩選CD34細胞，含有rhGM-CSF及rhIL-4 的RPMI-1640培養基繼續培養，顯微鏡和電鏡下繼續觀察，出現類似DCs形態的細胞時予CD1a純度檢測，比例大于90%可認定為初始DCs。

1.2.3 細胞分組與干預 DCs分為RelB、p38 siRNA及非干擾質粒(Snail及pGenesil-1)組。培養前30 min分別轉染RelB-Snail(干擾序列：5′-ATT CGT CGA TGA TTT CCA A-3′)、p38-pGenesil-1(干擾序列：5′-CGG ACT GGA TGG CCG TAC C-3′) SiRNA，Snail或pGenesil-1質粒，均為武漢晶賽生物工程技術有限公司構建，轉染液(100 μL)為含1.6 μg DNA與4 μL脂質體的培養基，根據分子克隆實驗指南完成轉染步驟。

1.2.4 DCs相關檢測

1.2.4.1 DCs胞內RelB、p38含量檢測 蛋白質印跡法(Western blotting)檢測DCs胞內RelB與p38含量，按照蛋白提取、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉膜、抗原抗體反應、顯影等步驟進行，AlphaEaseFC Version 4 軟件分析目的條帶的吸光度值。

1.2.4.2 DCs遷徙能力檢測 在侵襲小室下室加入l mL rhRANTES，上下室之間放置直徑12 mm的聚碳酸酯微孔膜，其上加入無血清的RPMI-1640稀釋的matrigel。取DCs(約1×105)加入侵襲小室的上室中，普通環境孵育6 h，取出聚碳酸酯微孔膜，擦去未穿膜細胞及matrigel，甲醇中固定30 min，Gimsa染色后光鏡下計數膜內細胞數并計算占總細胞數百分比，代表遷徙能力。每張隨機選取5個視野，取平均值。

2 結 果

2.1 不同給氧濃度IH/ROX時間比培養后DCs的遷徙能力 表1顯示不同低氧程度，IH/ROX時間比的IH環境下聚碳酸酯微孔膜中的細胞/總細胞數比例，代表DCs遷徙能力。16種IH條件下的平均遷徙比例為(0.48±0.06)%，正常對照下的比例為(0.57±0.05)%，二者相比差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。圖2為各種IH條件的平均氧分壓(APO2)與DCs遷徙能力的相關性分析情況，以APO2(單位：mm Hg)為自變量X，遷徙DCs比例為應變量Y，可得出回歸方程Y=0.009X-0.043(r=0.867，P<0.05)。

2.2 各組DCs RelB、p38的表達檢測 Western blotting檢測DCs胞內RelB、p38蛋白表達結果分別見圖3a、b，與正常對照比較，IH(給氧濃度1.5%，HO/ROX 1∶5)可誘導RelB、p38合成(P<0.05)；預先使用RelB-Snail及p38-pGenesil SiRNA可有效干擾IH下RelB、p38的合成(P<0.05)。

表1 不同低氧程度IH/ROX時間比條件下DCs的遷徙比例

*：P<0.05，與NH比較。

圖1 IH與NH環境下DCs的平均遷徙能力

圖2 IH條件下APO2與DCs遷徙能力的相關性分析

﹡，#:P<0.05，與IH環境比較。

圖3 Western blotting檢測各組RelB、p38的表達

2.3 DCs的遷徙能力 圖4中細胞質淡染，細胞核染色較深的細胞即為聚碳酸酯微孔膜中DCs。各組DCs的遷徙比例見圖5，顯示較常氧培養，IH可抑制DCs遷徙 (0.45%vs.0.62%，P<0.05)，RelB干擾(0.44%)或p38干擾(0.47%)對IH下DCs遷徙能力未造成明顯影響。

圖4 微孔膜中DCs的Gimsa染色(×100)

#:P<0.05，與NH比較。

圖5 DCs遷徙能力

3 討 論

OSAS目前并不鮮見，其最重要的致病機制為IH，可導致氧化應激及炎癥泛濫，是造成血管并發癥的重要原因。近來有研究報道，較之常氧，體外IH環境可導致DCs成熟表型及IL-12產生增加，刺激MLR增強，提示DCs很可能是異常炎性反應的介導者；且DCs參與冠狀動脈病變進展的設想亦得到了臨床研究的證實[4]。最近亦有研究報道，作為DCs的活性表現形式，高脂飲食大鼠的外周血成熟樹突狀細胞(mDCs)分布下降，而其主動脈管壁上的mDCs比例上升，外周血mDCs可能加速遷徙入動脈壁，提示作為AS發生過程中最重要的始動因素，AS模型外周血DCs比例下降可能并非其生成減少，而是其分布異常，遷徙到血管壁的DCs數量增加[5]。從上述研究結果可以推斷DCs致AS過程除了需要分化成熟及具備適當的免疫調節功能，遷徙能力同樣很重要，這樣DCs才能定植于血管內皮或歸巢淋巴結，帶來靶器官的損傷。因此，探討IH下DCs遷徙能力的改變特征及通路機制可以更全面地揭示DCs在OSAS血管并發癥中可能的作用，為干預OSAS并發癥提供新的防治策略。

有關體外持續低氧情況對DCs的遷徙能力的研究已有報道，如有研究者發現持續低氧下DCs的遷徙能力明顯下降，可能與低氧所導致的DCs表面基質金屬蛋白酶及其組織抑制劑(MMPs/TIMPs)家族的表達失衡有關[3,6-7]。而OSAS造成的缺氧為典型的IH，與持續低氧存在本質差別，所以本研究采用IH環境模擬人類OSAS氣相環境，并探討體外該環境對DCs遷徙能力的影像特征，這在國內外還鮮有報道，是本研究的新意之處。結果提示與常氧條件比較，體外IH可導致DCs遷徙能力下降，且遷徙能力與培養環境APO2呈正相關。結合以往的報道，IH環境雖可刺激DCs的成熟并增強MLR，但下降的遷徙能力可能影響DCs致損傷能力的發揮，提示IH可能存在靶器官損傷的保護機制，以上使筆者對DCs在OSAS致血管內皮損傷中的的真實地位產生懷疑。但仔細推敲，本實驗采用的是體外IH環境，與OSAS體內IH仍然存在差別。根據實驗結果，IH雖可能導致DCs遷徙能力下降，但IH同時造成的炎癥激活及AS病灶形成，可能又有利于趨化DCs[8-9]，故有必要開展進一步研究揭示DCs在OSAS人群體內真實的遷徙能力。

前期本研究人員利用基因芯片，IH下DCs胞內明顯表達上調的基因家族為核因子-κB(NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，其中，最為顯著的分別為RelB和p38。本實驗采用RNA干擾特異性干預IH環境下DCs RelB、p38的表達，結果示對其遷徙能力的改變無明顯影響，提示IH可能通過其他通路(如MMPs/TIMPs家族)的表達來調節DCs的遷徙。但也有研究支持在特定刺激下，細胞內Toll樣受體(TLRs)、NF-κBs及MAPKs的激活亦可能參與了MMPs表達的調節過程，從而影響遷徙[10-12]。本研究只選取了1種IH環境及1個觀察時間點，加之使用體外環境，故對OSAS人群體內DCs遷徙能力的改變情況及具體機制還未能完全揭示。研究結果雖未能系統闡述體外IH下DCs遷徙能力的改變與OSAS血管并發癥的關系，但這些遺留的問題值得在今后進一步挖掘探討，為預防OSAS血管并發癥提供全新的視角。

[1]Hu K,Yang Y，Tu Q,et al.The alteration on phenotype,function of human dendritic cells caused by intermittent hypoxia[J].Exp Ther Med,2016,121(3):96-102.

[2]胡柯，涂秋云，楊宇,等.ROS/TLR4/RelB,P38通路激活在間歇低氧致樹突狀細胞表型以及功能改變中的作用[J].免疫學雜志，2016,32(6):468-473.

[3]Song HB,Qu X，Yang MX,et al.Hypoxia inhibits the migratory capacity of human monocyte-derived dendrirtirc cells[J].Immunol Cell Biol,2005,83(6):668-673.

[4]李傳昶，劉薇，易軍,等.樹突狀細胞與冠狀動脈嚴重狹窄的關系及辛伐他汀的干預作用[J].中國動脈硬化雜志，2010,18(1):57-62.

[5]傅強，李志梁，雷霄,等.急性冠狀動脈綜合征患者外周血樹突狀細胞亞群數量及比例的變化[J].中華心血管病雜志，2008,25(3)：209-211.

[6]Osman M,Tortorella M,Londeri M，et al.Expressioin of matrix metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinases define the migratory characteristics of human monocyte-derived cells[J].Immunol,2002(105):73-82．

[7]Koropatnick T,Goodson MS,Heath-Heckman EA,et al.Identifying the cellular mechanisms of symbiont-induced epithelial morphogenesis in the squid-vibrio association[J].Biol Bull,2013,226(1):56-68.

[8]Sozzani S,Allavena P,Vecchi A,et al.The role of chemokines in the regulation of dendritic cell trafficking[J].J Leukoc Biol,1999(66):1-9.

[9]Schekman R.Discovery of the cellular and molecular basis of cholesterol control[J].Proc Natl Acad sci U S A 2013,110(37):14833-4836.[10]Osborne JK,Larsen JE,Shields MD,et al.NeuroD1 regulates survival and migration of neuroendocrine lung carcinomas via signaling molecules TrkB and NCAM[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110(16):6524-6529.

[11]Lee Y,Kim H,Kim KH,et al.Activation of toll-like receptor 2,3 or 5 induces matrixmetalloproteinase-1 and 9 expression with involvement of MAPKs and NF-κBs in human epidermal keratinocytes[J].Exp Dermatol,2010,19(8):e44-49.

[12]Morrell NW,Archer SL,Albert D,et al.Anticipated classes of new medications and molecular targets for pulmonary arterial hypertension[J].Pulm Circ,2013,3(1):226-244.

Study on the change of migration ability of dendritic cells induced by intermittent hypoxia and the mechanism of its pathway*

Hu Ke1,Wang Guangwei1△,Yang Yu2,Xu Guoyao1,LiYuxian1

(1.CollegeofClinicalMedicine,HunanUniversityofMedicine,Huaihua,Hunan418000,China;2.DepartmentofGeratology,theSecondXiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha,Hunan410013,China)

Objective By simulating the intermittent hypoxia(IH) environment of human obstructive sleep apnea syndrome(OSAS),to reveal the effect of IH on migratory ability of human peripheral blood derived dendritic cells(DCs),and through the intervention of RelB,p38 expression in order to explore the possible mechanism of the change of DCs migration ability induced by IH.Methods DCs were divided into RelB,p38 siRNA interfering and non interfering plasmid group before cultivation.The environment of hypoxia was created by a intermittent hypoxia cabin,among them,oxygen concentration was 0.5%,1.5%,5.0%,10.0%,hypoxia/reoxygenation time ratio was set as 1∶1,1∶3,1∶5 and 1∶9,while sustained oxygen was supplied to the contrast at a normal concentration of 21.0%.The content of RelB and p38 was tested by Western blotting after culture in vitro,migration ability of DCs was detected by invasion chamber.Results Compared with normoxia,DCs under IH tended to have declined migratory ability,which was confirmed to be correlated with the average oxygen partial pressure level under IH.IH could promote the expression of RelB and p38 in DCs,while the migratory ability of DCs was not reversed after intervening the expression of RelB and p38.Conclusion IH in vitro could cause a decline in migratory ability of DCs,which may not be induced by activation of RelB or p38 in DCs.

intermittent hypoxia;dendritic cells；migratory ability；RelB；p38

湖南省自然科學基金資助項目(SK201222032)。 作者簡介：胡柯(1984-),講師，博士，主要從事缺血性心腦血管病的臨床及基礎研究。△

R392.12

A

1671-8348(2016)30-4200-03

2016-04-02

2016-07-10)