雌激素受體α、β亞型在血管瘤血管內皮細胞的表達分析*

宋曉峰，王 寧，李亞莎，周德凱，金先慶，王 佚，李曉慶

(重慶醫科大學附屬兒童醫院胃腸外科及新生兒外科/兒童發育疾病研究教育部重點實驗室/重慶兒童發育重大疾病診治與預防國際科技合作基地/兒科學重慶市重點實驗室，重慶 400014)

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·論 著· doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.30.007

雌激素受體α、β亞型在血管瘤血管內皮細胞的表達分析*

宋曉峰，王 寧，李亞莎，周德凱，金先慶，王 佚，李曉慶

(重慶醫科大學附屬兒童醫院胃腸外科及新生兒外科/兒童發育疾病研究教育部重點實驗室/重慶兒童發育重大疾病診治與預防國際科技合作基地/兒科學重慶市重點實驗室，重慶 400014)

目的 探討雌激素受體亞型α(ERα)和β(ERβ)在鼠源性血管瘤內皮細胞(EOMA)上的表達及其意義。方法 通過免疫組織化學法檢測ERα和ERβ在EOMA上的表達與分布，通過免疫組織化學法及實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)研究ERα和ERβ的表達水平。結果 免疫組織化學法顯示ERα、ERβ均表達在EOMA細胞的細胞質。免疫組織化學法及RT-PCR均提示ERα表達水平明顯高于ERβ，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 ERα、ERβ均表達在EOMA細胞的細胞質，ERα表達水平明顯高于ERβ。

雌激素受體亞型α；雌激素受體亞型β；鼠源性血管瘤內皮細胞；體外培養；血管瘤

血管瘤是嬰幼兒最常見的腫瘤，其病因及發病機制目前仍不清楚。研究發現，血管瘤的發生及生長與雌激素及其受體密切相關[1-2]。學者推測血管瘤的生長存在雌激素依賴性[3]。雌激素通過雌激素受體(estrogen receptor，ER)發揮生理效應。ER有兩種亞型，即α和β亞型，兩種亞型在結構上高度同源，功能卻存在很大的差異，推測兩者在血管瘤的發生、發展中可能發揮不同的作用。本研究擬通過免疫組織化學法及實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測ER α、β亞型在血管瘤內皮細胞(EOMA)上的表達特征及分布規律。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞株及主要試劑，細胞：EOMA細胞，購自美國典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。Dulbecco氏改良Eagle培養基/F-12(DMEM/F-12)細胞培養液購自美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自美國Invitrogen公司；兔抗小鼠ERα抗體、兔抗小鼠ERβ抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；兔SP檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術公司；逆轉錄試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；引物序列由北京六合華大科技股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 EOMA細胞培養和傳代 EOMA細胞接種在含10%FBS的DMEM/F-12高糖培養基中，置于5%二氧化碳(CO2)、37 ℃、飽和濕度的培養箱中培養。常規傳代培養，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 免疫組織化學檢測ERα、β的表達 將用0.01%多聚賴氨酸處理的無菌蓋玻片放人6孔板中，每孔加入2 mL對數生長期的EOMA單細胞懸液，細胞密度1×106/mL。細胞貼壁后換液繼續培養48 h后取出細胞爬片。采用SP免疫組織化學試劑盒，卵白素-生物素-辣根過氧化物酶復合物法(ABC法)分別測定細胞α、β受體亞型表達(按照試劑盒說明書流程進行)。用二氨基聯苯胺(DAB)顯色，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對照。以棕黃色著色為陽性，通過觀察棕褐色染色的分布反映ERα、β的表達部位。通過圖像分析系統觀察各10張爬片20個視野下陽性表達的面積及平均光密度值，比較二者的表達強度。

1.2.3 RT-PCR檢測ERα、β mRNA的表達 收集培養瓶對數生長期生長良好的EOMA細胞，采用Trizol提取總RNA，并溶于二乙基焦磷酸胺溶液。采用紫外分光光度儀于260、280 nm處測定RNA的濃度及純度。擴增ERα上游引物為：5′-CAT TAT GGG GTC TGG TCC TGC G-3′，下游引物為：5′- GCC CAC TTC GTA ACA CTT GC-3′，PCR擴增片段長度為162 bp；擴增ER β上游引物為：5′-CCG ACT TCG CAA GTG TTA CG-3′，下游引物為：5′- CCC ACT GGT TCT CTT GGC TTT G-3′，PCR 擴增片段長度為139 bp；擴增β-actin上游引物為：5′-AAG ATG ACC CAG ATC ATG TTT GAG ACC-3′，下游產物為：5′-GCC AGG TCC AGA CGC AGG AT-3′，PCR 擴增產物長301 bp。根據逆轉錄試劑盒提供的流程合成cDNA。實時定量PCR反應為兩步法，反應條件： 95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，54～60 ℃延伸/退火30 s，39個循環；65～95 ℃溶解曲線分析。

2 結 果

2.1 ERα、ERβ在EOMA細胞上的分布 見圖1。

A：ERα;B： ERβ。

圖1 ERα、ERβ在EOMA細胞上的表達(DAB染色，蘇木精復染，×400)

2.2 免疫組織化學法檢測ERα、ERβ在EOMA細胞上的表達 ERα的表達面積與表達強度均高于ERβ，差異均有統計學意義(P值分別為0.013、0.006)。見表1。

表1 ERα、ERβ在EOMA細胞上的表達面積及表達強度比較

2.3 實時熒光定量PCR檢測ERα、ERβ在EOMA細胞上的表達分析 ERα的循環閾值(cycle threshold，Ct值)為(27.46±0.09)，ERβ的Ct值為(33.84±0.07)，ERα與ERβ的Ct值比較，差異有統計學意義(P=0.026)，提示ERα起始模板拷貝數明顯高于ERβ在EOMA上的表達，見圖2～3。

圖2 ERα擴增曲線

圖3 ERβ擴增曲線

3 討 論

血管瘤是嬰幼兒常見疾病，部分血管瘤可出現嚴重的并發癥，給患兒帶來痛苦，并造成患兒機體功能及容貌嚴重毀損。血管瘤的發病原因及影響血管瘤生長的因素目前仍不清楚。學者對血管瘤進行了大量研究，發現血管瘤的發生及生長與雌激素密切相關[1-2]。臨床觀察發現血管瘤瘤體增生與高水平雌激素有著密切聯系：婦女妊娠時發生的血管瘤，分娩后可自行縮小或消退；肝硬化患兒由于肝功能減退，滅活雌激素的能力降低而出現肝掌、蜘蛛痣；月經期增大并伴疼痛的巨大皮膚血管瘤患者行子宮卵巢切除術后腫瘤生長抑制，疼痛緩解；血管瘤患兒女性明顯多于男性。本課題組前期研究也發現，血管瘤患兒血清雌二醇(E2)水平明顯高于對照組[4-5]。

經典理論認為雌激素通過與其受體結合而發揮生理作用，雌激素對靶組織具有顯著的促絲裂效應，當其到達靶細胞后，與細胞質內的受體結合形成復合物后再進入細胞核內，在胞核內雌激素再與核受體結合，引起ER構象變化，暴露DNA結合區，激活順式作用元件使轉錄增強，蛋白質合成增多，進而影響靶細胞的代謝與功能。ER是一類由配體激活的轉錄因子，是核受體超家族的成員。雌激素的生理作用主要由ER的α、β兩種亞型介導[6-7]。

ERα與ERβ同屬核受體家族，在DNA結合區同源性達96%，在配體結合區則為53%，二者可形成同源或異源二聚體，進而形成轉錄復合物與雌激素反應元件結合啟動轉錄[8]。但研究顯示二者的功能并不相同，其由不同的基因編碼，具有不同的cDNA和蛋白質分子結構，可導致差異性的轉錄應答，芯片分析揭示兩種ER不但調控著不同的基因表達，而且由于它們以不同的親和力結合相同的配基，差異性地調控同一基因的表達，從而引發不同的應答及受體信號瀑布的回應，因此通過不同的信號通路對雌激素靶器官和組織的生理、病理產生不同的影響，ERβ甚至可以抑制ERα的轉錄活性，二者在不同的性別、年齡及身體部位的表達都顯示出明顯差異[9-12]。

E2作用的靶組織分為經典和非經典兩大類。經典的靶組織有子宮、乳腺、胎盤、肝臟、中樞神經系統、心血管系統、骨骼等，它們含有大量的ERα，與E2相互作用后可增強其下游基因的轉錄水平。非經典的靶組織包括前列腺、睪丸、卵巢、甲狀腺、甲狀旁腺、腎上腺、胰腺、膽囊、泌尿道、淋巴細胞和紅細胞等，ERα在這些組織細胞中低表達或不表達，ERβ在這些組織中高表達。除了在組織分布方面的不同外，ERα和ERβ的轉錄活性及其與協同因子的相互作用也往往不同。

學者推測血管瘤發生及生長存在雌激素依賴性，但ERα和ERβ在血管瘤組織中各自的表達情況及雌激素對二者的作用機制目前尚未見文獻報道。本研究通過免疫組織化學法及RT-PCR檢測ERα和ERβ在EOMA細胞上的表達特征及分布規律，分析血管瘤組織中以何種亞型為優勢受體亞型，在介導雌激素對血管瘤血管內皮細胞增殖中發揮主導生物學作用。通過免疫組織化學發現，ERα和ERβ均主要在細胞質表達。通過圖像分析系統發現在同等數量的細胞爬片上各個視野的表達面積有明顯差異，ERα陽性表達面積比ERβ明顯增多(P<0.05)；ERα表達強度明顯高于ERβ(P<0.001)。

通過RT-PCR技術，觀察ERα、ERβ的Ct值的差異。Ct值是每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數，也是熒光信號開始由本底進入指數增長階段的拐點所對應的循環次數。模板DNA量越多，熒光達到閾值的循環數越少，即Ct值越小。Ct值與模板DNA的起始拷貝數成反比。實驗發現：ERα的Ct值為(27.46±0.09)，ERβ的Ct值為(33.84±0.07)，ERα、ERβ間比較在Ct值上差異有統計學意義(P=0.026)，ERα起始模板拷貝數明顯高于ERβ在EOMA上的表達，即ERα相對高表達，ERβ相對低表達。

由此可以看出：ERα、ERβ在EOMA細胞上均有表達，ERα的表達明顯高于ERβ，可能是血管瘤上皮細胞的優勢ER，可能屬于經典靶組織。雌激素對血管瘤血管內皮細胞的生長的調節可能通過ERα、ERβ兩條路線，但雌激素信號在什么條件下激活α受體，在哪種條件下影響β受體尚未了解；由于α和β受體介導雌激素信號的路線可能不一樣，具有不同的生物學作用，二者是共同介導雌激素對血管瘤上皮細胞的生長，還是相互拮抗發揮生物學效應仍需要后續的實驗進一步研究。

本研究結果顯示，ERα、ERβ在EOMA細胞的細胞質上均有表達，二者表達有明顯差異。它們在血管瘤上皮細胞增殖中的作用機制尚待進一步研究。本研究擬進一步探索雌激素亞型在血管瘤上皮細胞增殖中的作用機制和信號通路，為血管瘤的基因或內分泌治療提供新的靶點，為診斷及指導治療提供依據；為這兩種亞型在血管瘤生長中的不同生理作用提供新的基礎資料。

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The expression and distribution of estrogen receptor subtypes α and β in hemangioma endothelial cells﹡

Song Xiaofeng,Wang Ning,Li Yasha,Zhou Dekai,Jin Xianqing,Wang Yi,Li Xiaoqing

(DepartmentofGastrointestinalandNeonatalSurgery,theChildren′sHospitalAffiliatedtoChongqingMedicalUniversity/MinistryofEducationKeyLaboratoryofChildDevelopmentandDisorders/ChongqingInternationalScienceandTechnologyCooperationCenterforChildDevelopmentandDisorders/KeyLaboratoryofPediatricsinChongqing，Chongqing400014,China)

Objective To investigate the expression and distribution of estrogen receptor(ER) subtypes α,β in murine endothelial (EOMA) cells and to assess the significance of ERα,β in EOMA cells.Methods Expression and distribution of ERα,β in EOMA cells in vitro were detected by using immunohistochemistry.The expression level of ERα,β in EOMA cells were quantitatively evaluated by immunohistochemistry and real-time fluorescence quantitative (RT-PCR)．Results Immunohistochemistry showed that ERα and ERβ were expressed in the cytoplasm of EOMA cells.The expression levels of ERα detected by using immunohistochemistry and RT-PCR method both were significantly higher than those of ERβ(P<0.05).Conclusion ERα and ERβ are expressed in the cytoplasm of EOMA cells,and expression level of ERα is significantly higher than that of ERβ.

estrogen receptor α;estrogen receptor β；murine endothelial cells；in vitro culture；hemangioma

國家臨床重點專科建設項目(國衛辦醫函[2013]544)；重慶市自然科學基金資助項目(cstc2011jjA10087)；重慶市衛生局基金資助項目(2011-2-252)；重慶市教委科學技術研究資助項目(KJ120308)。 作者簡介：宋曉峰(1970-)，副主任醫師，博士，主要從事血管瘤發病機制及治療研究。

R726.5

A

1671-8348(2016)30-4197-03

2016-03-20

2016-06-28)