CD4+CD25+調節性T細胞及其相關因子在惡性腫瘤患者胸腔積液及外周血中的表達

羅玲娟,張立平,謝新梅,張洪亮

(新疆醫科大學附屬中醫醫院腫瘤二科, 新疆 烏魯木齊　830000)

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CD4+CD25+調節性T細胞及其相關因子在惡性腫瘤患者胸腔積液及外周血中的表達

羅玲娟,張立平,謝新梅,張洪亮

(新疆醫科大學附屬中醫醫院腫瘤二科, 新疆 烏魯木齊830000)

目的：探討CD4+CD25+調節性T細胞及其相關因子在惡性腫瘤患者胸腔積液及外周血中的表達。方法：選取42例惡性腫瘤胸腔積液患者為研究組，38例健康體檢者為對照組，采用流式細胞儀(FCM)和酶聯免疫法(ELISA)檢測研究組胸腔積液和外周血、對照組外周血中CD4+CD25+/CD4+比例、淋巴細胞亞群以及轉化生長因子-β1(TGF-β1)、白細胞介素-10(IL-10)和干擾素-γ(IFN-γ)水平。結果：研究組胸腔積液及外周血中CD4+CD25+/CD4+比例及TGF-β1、IL-10水平均顯著高于對照組(P<0.01)，且胸腔積液高于外周血(P<0.01)，而IFN-γ水平顯著低于對照組，且胸腔積液低于外周血(P<0.01)。結論：對惡性腫瘤患者外周血和胸腔積液中CD4+CD25+調節性T細胞及TGF-β1、IL-10和IFN-γ水平進行檢測有利于判斷病情預后和轉歸。

CD4+CD25+;調節性T細胞;抑制因子;胸腔積液;免疫

調節性T細胞是一類具有免疫抑制功能的T細胞亞群，主要通過細胞-細胞直接接觸的方式發揮免疫抑制效應，T細胞的活化、增殖或異常表達能調節獲得性免疫系統，會引發疾病不同的發展，阻止自身免疫疾病的發生[1]。其以自然產生的CD4+CD25+調節性T細胞研究最多，調控效能主要限于CD4+CD25+亞型[2]。由于調節性T細胞獨特的生物學功能，其在自身免疫性疾病的發生、腫瘤發生與轉歸上越來越受到重視，且在慢性感染性疾病中的作用成為近年來免疫學研究的熱點[3-4]。本研究通過檢測惡性腫瘤患者外周血和胸腔積液中CD4+CD25+調節性T細胞的表達，探討其機制及變化，現報告如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2013年4月至2015年2月新疆醫科大學附屬中醫醫院收治的惡性腫瘤胸腔積液患者42例為研究組，均經組織病理學或細胞學確診為惡性腫瘤，且胸腔積液中檢出癌細胞，其中男23例，女19例；平均年齡(38.21±13.87)歲。另選取健康體檢者38例為對照組，其中男20例，女18例；平均年齡(37.71±12.63)歲。

1.2方法

1.2.1實驗試劑異硫氰酸熒光素FITC標記的小鼠抗人CD4抗體，藻紅蛋白PE標記的小鼠抗人CD25抗體，PE-Cy-CD4同型陰性對照試劑(以上試劑均購于Beckman-Coulter公司，于4 ℃保存備用)；轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)的ELISA試劑盒(BioSource公司)。

1.2.2細胞制備采集研究組患者中靜脈血10 mL，加入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，梯度離心分離淋巴細胞，1640培養基洗滌2次，再以含1%胎牛血清的1640培養基重懸細胞并計數，稀釋細胞濃度至1×106/mL，取1 mL細胞懸液置于試管中。以1 500 rmp離心10 min后，棄上清，分別取FITC標記的CD4+抗體和PE標記的CD25+抗體20 μL。分別加入單抗后于4 ℃中避光孵育30 min，加1%BSA-PBS液離心并洗滌，重復2次，稀釋至300 μL。對照組經相同處理，稀釋至300 μL并移入試管中，待檢測分析。

1.2.3檢測方法①采用Becton Dikisob FACS Gablibur流式細胞儀測定淋巴細胞標記后熒光強度。熒光強度以二維dot-plot散點圖自動分析，結合某一單抗的陽性細胞個數和百分比，在FITC-CD4/PE-CD25雙參數圖上計算CD4+CD25+T細胞比例。CD4+CD25+T細胞(%)=(CD4+CD25+T細胞數)/CD4+T細胞數×100%；②采用酶聯免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測兩組TGF-β1、IL-10和IFN-γ水平，嚴格按照試劑盒說明操作，并測光密度(optical density，OD)值。以標準品含量為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，并計算樣本濃度，以pg/mL為單位。對照組采集檢測同上。

1.3統計學方法

2　結果

2.1兩組調節性T細胞檢測結果比較

研究組胸腔積液和外周血中CD4+CD25+/CD4+比例明顯高于對照組(P<0.01)；研究組胸腔積液中CD4+CD25+/CD4+比例顯著高于外周血，差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。

表1　兩組調節性T細胞檢測結果比較±s)

*P<0.01，與對照組比較； #P<0.01，與外周血比較。

2.2兩組TGF-β1、IL-10和IFN-γ水平比較

研究組胸腔積液及外周血中TGF-β1、IL-10水平顯著高于對照組，且胸腔積液高于外周血，而IFN-γ水平顯著低于對照組，且胸腔積液低于外周血，差異均有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2　兩組TGF-β1、IL-10和IFN-γ水平比較

*P<0.01，與對照組比較； #P<0.01，與外周血比較。

3　討論

調節性T細胞是一類負向免疫細胞，CD4+CD25+調節性T細胞具有免疫無能性和免疫抑制性兩大特點[5]。免疫無能性表現在受到抗原刺激后，既不增生也無IL-2分泌等T細胞活化現象；免疫抑制性表現為能抑制CD4+、CD8+T細胞亞群，可產生TGF-β1、IL-10等抑制性細胞因子，調節效應T細胞，經細胞接觸、競爭抑制等方式發揮作用，通過影響細胞凋亡和增殖過程來影響機體的天然免疫和獲得性免疫[6-8]。同時，其可抑制IFN-γ的產生，這一過程在抑制自身免疫疾病的產生的同時也參與腫瘤免疫調節[9]。

研究[10]發現，CD4+CD25+調節性T細胞能抑制CD4+、CD8+T淋巴細胞、自然殺傷T細胞(natural killer T cells，NKT細胞)、B淋巴細胞、樹突細胞以及單核/巨噬細胞的分化，并能影響這些細胞的效應功能。機體內抗原被CD4+CD25+調節性T細胞識別后，調節性T細胞活化進而發揮免疫作用，影響疾病預后[11]。本研究通過檢測惡性胸腔積液患者胸腔積液及外周血中CD4+CD25+調節性T細胞的分布，發現研究組胸腔積液和外周血中CD4+CD25+/CD4+比例明顯高于對照組，且胸腔積液中CD4+CD25+/CD4+比例顯著高于外周血，表明CD4+CD25+調節性T細胞可能參與了惡性腫瘤的發病，且CD4+CD25+調節性T細胞更易被趨化至胸腔積液中，與陳一強等[12]研究結果一致，提示CD4+CD25+調節性T細胞可作為患者免疫狀態、療效觀察的指標，對臨床指導有一定價值。

IL-10和TGF-β1可誘導針對腫瘤特異性抗原的免疫耐受，通過外周耐受抑制自身反應性T細胞活性的機制，影響自身免疫系統的應答[13]。本研究結果顯示，研究組胸腔積液及外周血中TGF-β1、IL-10水平顯著高于對照組，且胸腔積液高于外周血，說明細胞因子與患者的免疫調節功能有關；而IFN-γ水平低于對照組，且胸腔積液低于外周血，說明CD4+CD25+調節性T細胞能抑制IFN-γ的表達。由此可見，CD4+CD25+調節性T細胞扮演著重要的免疫調節角色，可能直接參與了腫瘤的進展，影響病程發展，且比例增高預示著患者胸腔局部免疫反應存在抑制狀態。因此，下調CD4+CD25+調節性T細胞有助于提高機體抗腫瘤免疫[14-15]。

綜上所述，對惡性胸腔積液患者外周血和胸腔積液中CD4+CD25+調節性T細胞及TGF-β1、IL-10和IFN-γ水平進行檢測有利于判斷病情預后和轉歸，有望為判斷病情發展、實施有效干預提供新的思路。

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(學術編輯：趙妍麗)

Expression of CD4+CD25+regulatory T cells and their relevant factors in pleural effusion and peripheral blood of patients with malignant tumors

LUO Ling-juan,ZHANG Li-ping,XIE Xin-mei,ZHANG Hong-liang

(SecondDepartmentofOncology,TraditionalChineseHospitalAffiliatedtoXinjiangMedicalUniversity,Urumchi830000,Xinjiang,China)

Objective：To explore the expression of CD4+CD25+regulatory T cells and their relevant factors in pleural effusion and peripheral blood of patients with malignant tumors.Methods：Forty-two patients with malignant pleural effusion were selected as the research group,and 38 healthy people were selected as the control group.The CD4+CD25+/CD4+proportion,lymphocyte subsets,levels of transforming growth factor-β1 (TGF-β1),interleukin-10 (IL-10) and interferon-γ (IFN-γ) in pleural effusion and peripheral blood in the research group as well as peripheral blood in the control group were detected using flow cytometry (FCM) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).Results：The CD4+CD25+/CD4+proportion,levels of TGF-β1 and IL-10 in pleural effusion and peripheral blood in the research group were significantly higher than those in the control group (P<0.01),but all the above markers in pleural effusion were prominently higher than those in peripheral blood (P<0.01).In the research group, the levels of IFN-γ in pleural effusion and peripheral blood were notably lower than those in control group,in which those in pleural effusion were lower (P<0.01).Conclusion：Detection of CD4+CD25+regulatory T cells and levels of TGF-β1,IL-10 and IFN-γ in pleural effusion and peripheral blood of patients with malignant tumors is conductive to judging the disease prognosis and outcome.

CD4+CD25+;Regulatory T cells;Inhibitors;Pleural effusion; Immune

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.03.036

2016-01-16

羅玲娟(1981-)，女，碩士，主治醫師。E-mail：Lt7912@126.com通訊作者:張洪亮，E-mail: zhanghongliang@csco.cn

時間：2016-6-1617∶46

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160616.1746.072.html

1005-3697(2016)03-0413-03

R730.2

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