線粒體轉錄復合物各因子質粒標準品的構建

羅德艷，馮俊

(川北醫學院第二臨床醫學院·南充中心醫院耳鼻喉科，四川 南充　637000)

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線粒體轉錄復合物各因子質粒標準品的構建

羅德艷，馮俊

(川北醫學院第二臨床醫學院·南充中心醫院耳鼻喉科，四川 南充637000)

目的：構建大鼠線粒體轉錄因子TFAM(A)、線粒體轉錄因子TFB1M (B1)、線粒體轉錄TFB2M (B2)及線粒體RNA聚合酶(POLRMT)的質粒標準品，為檢測內耳細胞線粒體TFAM、TFB1M、TFB2M、POLRMT 的mRNA表達水平做基礎。方法：設計特異性引物和探針，提取大鼠內耳組織總mRNA逆轉錄成cDNA，PCR擴增、純化目的片段，將純化產物與pZeroBack/blunt 載體重組，提取重組質粒，經測序鑒定后，用實時熒光絕對定量PCR建立標準曲線。結果：測序結果與各目的序列一致，獲得良好的標準曲線(R2>0.99)。結論：成功構建了各目的基因的質粒標準品。

線粒體轉錄因子A；線粒體轉錄因子B1；線粒體轉錄B2；線粒體RNA聚合酶；質粒標準品；實時熒光定量PCR

線粒體通過氧化磷酸化(OXPHOS)產生ATP為細胞提供直能量，OXPHOS過程所需蛋白的其中13個蛋白由線粒體DNA(mtDNA)編碼[1-2]。當線粒體蛋白合成受限時，導致氧化磷酸化功能障礙，引起線粒體代謝障礙疾病、癌癥、神經變性疾病、老化、年齡相關性疾病，這時負責線粒體基因轉錄的主要調節顯得由為重要[1-3]，所以調節線粒體基因的表達是一潛在的預防、治療線粒體功能障礙的途徑。mtDNA轉錄激活體系主要有TFAM，POLRMT和TFB2M/TFB1M組成，缺一不可[4-5]。最早發現的線粒體轉錄因子為TFAM，與HSP和LSP啟動子區的調控元件結合后再與POLRMT及其它因子形成轉錄復合物，啟動轉錄[6]。TFB1M和TFB2M為雙功能蛋白，具有同源性，都有甲基化轉移酶活性及激活mtDNA轉錄功能，與TFAM的C端和POLRMT結合，在H鏈和L鏈的轉錄起始位點引發轉錄，但TFB2M激發轉錄的效率比TFB1M高[7-8]。POLRMT與T7 噬菌體RNA聚合酶具有同源性[9]，為DNA依賴性酶，但不能自己結合mtDNA而激活其轉錄，而需要與TFAM，TFB2M/TFB1M結合才能完成這一任務[10]。本研究利用pZeroBack/blunt為載體成功構建大鼠的TFAM、TFB1M、TFB2M、POLRMT的質粒標準品，為研究各線粒體轉錄因子在內耳的表達水平奠定基礎，進一步研究線粒體轉錄因子在內耳疾病中的作用機制，為內耳疾病的發生機制和防治提供新思路。

1　材料和方法

1.1材料

TOP10感受態細胞、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒小提試劑盒、ZeroBack Fast Ligation Kit試劑盒、2×Taq PCR MasterMix均購自天根生化科技(北京)有限公司，Trizol RNA提取試劑盒為Invitrogen公司，PCR引物和探針、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Erase、Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)、DNA Marker均購自日本TaKaRa公司，普通PCR儀Biometra(德國)，實時熒光定量PCR儀ABI(美國)，大鼠由川北醫學院動物實驗提供。

1.2方法

1.2.1引物和探針在GenBank中查找TFAM、TFB1M、TFB2M、POLRMT基因，獲得各目的基因序列，由TaKaRa公司設計并合成引物和探針，見表1。

表1　引物和探針

1.2.2總RNA的提取清潔級大鼠6只，斷頭處死后立即取出內耳，顯微鏡下解剖出血管紋、螺旋韌帶、基底膜、橢圓囊、球囊等內耳組織，按Trizol RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，-80 ℃保持備用。

1.2.3cDNA的合成反應總體積為20 μL，5×gDNA Erase Buffer 2.0 μL、gDNA Eraser 1.0 μL、Total RNA 5.0 μL、PrimeScript Rt Enzyme MixⅠ1.0 μL、RT Primer Mix 1.0 μL、5×PrimeScript Buffer 2 4.0 μL、RNase Free d H2O 6.0 μL，37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 sec、4 ℃ 5 min，在普通PCR儀上逆轉錄為cDNA，-20 ℃儲存備用。

1.2.4目的基因PCR擴增及純化反應體系總體積為50 μL，cDNA 3 μL，引物2 μL，2×Master Mix 25 μL，dd H2O 20 μL。94 ℃預變性3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個循環，72 ℃延伸 5 min。將擴增產物30 μL上樣在3%瓊脂糖凝膠進行電泳，按普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的DNA條帶，回收的DNA置于-20 ℃保存。

1.2.5重組質粒連接反應按照ZeroBack Fast Ligation Kit試劑盒的說明書進行。將連接產物轉化到TOP10感受態細胞，進行氨芐青霉素瓊脂糖平板培養，挑選菌落，37 ℃過夜12～16 h。

1.2.6提取質粒及鑒定按質粒小提試劑盒說明書提取質粒，然后進行普通PCR及測序鑒定。陽性質粒經測序后，測定質粒質量濃度。

1.2.7標準曲線的建立采用Premix Ex TaqTM (Probe qPCR)實時定量法配置反應體系后進行實時熒光定量PCR。采用10倍比梯度稀釋方法配制各濃度的質粒標準品，共配成7個梯度濃度的標準品作為模板在實時熒光定量PCR儀上擴增。反應總體系為20.0 μL ，Premix Ex Taq(Probe qPCR) (2×) 10.0 μL、上下游引物各0.4 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL、Probe 0.2 μL、cDNA template 4.0 μL、ddH2O 4.6 μL。第一步預變性30 s，第二步95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。反應結束后系統自動生成標準曲。

2　結果

2.1電泳檢測PCR擴增的目的片段

以cDNA為模板，PCR擴增目的基因片段，取擴增產物30 μL上樣3%瓊脂糖凝膠電泳，得到目的基因條帶，回收目的基因片段經純化、連接、轉化后，提取重組粒進行3%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示片段與預計大小符合，表明目的質粒重組成功，見圖1。

2.2測序結果

將含有目的基因的重組質粒菌液送往武漢擎科生物技術有限公司測序并檢測濃度，其結果與GenBank中的各序列對比分析，序列一致，成功構建各目的基因質粒，見圖2。

2.3標準曲線的構建

將已知濃度的標準品進行實時熒光定量PCR反應，系統根據初始模板量對數和Ct值的線性關系，系統自動生成標準曲線，見圖3。各基因的相關系數R2>0.99，擴增效率在97%～100%，斜率在-3.483～3.308，成功建立了各目的基因的標準曲線，見圖3。

3　討論

實時熒光定量PCR是指在反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監測PCR進程，熒光信號的強度與產物量成線性關系，通過標準曲線得到樣本拷貝數絕對值，從而對起始樣本進行定量分析，廣泛應用于mRNA的表達，DNA的拷貝數的研究，常用的熒光方法有DNA結合染料法、引物探針法、水解探針法、雜交探針法[11]，分相對定量和絕對定量，兩者的區別是絕對定量已知標準品的拷貝數，需要構建目的基因標準質粒和標準曲線[12]。本研究采用絕對定量，使用TaqMan探針法，探針的5′端有報告基團，3′端有淬滅基團，在PCR反應體系中，同時加入引物、特異性熒光探針，退火時引物和探針同時和與模板結合，引物介導模板延伸，當到達探針結合處時Taq酶發揮5′→ 3′ 外切酶活性,切離探針5′端的熒光基團，與3′熒光淬滅基團分離,釋放熒光信號[13-14]，所以擴增一條 DNA鏈, 生成一個熒光分子, PCR 反應結束，熒光基團生成也隨即結束，也就是說熒光基團數和PCR產物數一一對應，從而對模板準確定量。

本研究使用的pZeroBack/blunt載體為陽性選擇克隆載體，含有致死的限制酶基因(內含多克隆位點)，多克隆位點插入外源片段會引起酶基因失活，只有轉化了重組質粒的細菌才能存活形成克隆菌落。而無外源片段插入的 pZeroBack/blunt 載體表達致死的限制酶，轉化后殺死大腸桿菌細胞，無需藍白斑篩選，加速了克隆篩選進程，縮短了實驗時間。將重組的質粒10倍連續稀釋7個濃度，作為絕對定量PCR的標準模板，反應結束后系統自動生成標準曲線，根據直線方程得到樣本拷貝數絕對值,具有高度特異性、高度靈敏性、重復性好、陰性結果確定、操作簡便等優點，可長期用于檢測。

本實驗結果表明CT值在10～35 Hu，可覆蓋全部樣品濃度區間，R2>0.99, 說明相關系數高，線性關系好，擴增效率>97%,各樣本擴增效率一致性強，表明整個實驗過和和實驗數據是可信的，這些標準品質粒可用于后續的研究。利用實時熒光絕對定量PCR檢測不同年齡段大鼠內耳TFAM、TFB1M、TFB2M、POLRMT的mRNA表達水平變化，進行定量分析，較常規的RT-PCR精確。

[1]Guaragnella N,Giannattasio S,Moro L.Mitochondrial dysfunction in cancer chemoresistance[J].Biochem Pharmacol,2014,92(1):62-72.

[2]Cha MY,Kim DK,Mook-Jung I.The role of mitochondrial DNA mutation on neurodegenerative diseases[J].Exp&Mol Med,(2015)47,e150；doi:10.10381emm.2014.122.

[3]Wallace DC.A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases,aging,and cancer:a dawn for evolutionary medicine[J].Annu Rev Genet,2005,39:359-407.

[4]Falkenberg M,Gaspari M,Rantanen A,etal.Mitochondrial transcription factors B1 and B2 active transcription of human mtDNA[J].Nat Genet,2002,31(3):289-294.

[5]Asin-Cayuela J,Gustafsson CM.Mitochondrial transcription and its regulation in mammalian cells[J].Trends Biochem Sci,2007,32(3):111-117.

[6]Liu G,Yang RF,Shi BY,etal.Prokayotic expression and purification of mitochondrial transcription complex proteins[J].Acta Academiae Medicinae Sinicae,2011,33(6):638-643.

[7]Cotney J,McKay SE,Shadel GS.Elucidation of separate,but collaborative functions of the rRNA methyltransferase-related human mitochondrial transcription factors B1 and B2 inmitochondrial biogenesis reveals new insight into maternally inherited deafness [J].Hum Mol Genet,2009,18(14):2670-2682.

[8] Zhang HS,Maguire DJ,Zhang M,etal.Elevated mitochondrial DNA copy number and POL-γ expression but decreased expression of TFAM in murine intestine following therapeutic dose irradiation[J].Adv Exp Med Biol,2011,701:201-206.

[9]Ringel R,Sologub M,Morozov YI,etal.Structure of human mitochondrial RNA polymerase[J].Nature,2011,478(7368):269-273.

[10]Gaspari M,Falkenberg M,Larsson NG,etal.The mitochondrial RNA polymerase contributes critically to promoter specificity in mammalian cells[J].EMBO J,2004,23(23):4606-4614.

[11] Navarro E,Serrano-Heras G,Castao MJ,etal.Real-time PCR detection chemistry[J].Clin Chim Acta,2015,439(15):231-250.

[12]劉小榮，張笠，王勇平．實時熒光定量 PCR 技術的理論研究及其醫學應用[J].中國組織工程研究與臨床康復，2010，14(2):329-332.

[13]Gasparic MB,Cankar K,Zel J,etal.Comparison of different real-time PCR chemistries and their suitability for detection and quantification of genetically modified organisms[J].BMC Biotechnol,2008,8:26.

[14]劉波，郭紅艷.基于TaqMan探針的熒光定量PCR技術在PCV2檢測中應用研究[J].中國病原生物學雜志,2015,10(2):139-143.

(學術編輯：敬保遷)

Construction of each plasmid standard of the mitochondrial transcription complex

LUO De-yan，FENG Jun

(DepartmentofOtolaryngology,NanchongCentralHospital,TheSecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China)

Objective：To form the basis of detecting the expression of TFAM,TFB1M,TFB2M and POLRMT mRNA of inner ear, the plasmid standards of mitochondrial transcription factor TFAM (A),mitochondrial transcription TFB1M (B1),mitochondrial transcription TFB2M (B2) and mitochondrial RNA polymerase (POLRMT) of rat were constructed.Methods：Specific primers and probes were designed,total mRNA was extracted from rat inner ear tissues and reverse transcribed to cDNA using the specific primers.Purified target fragments from amplified objective gene sequences through PCR were transformed to pZeroBack/blunt vector to establish recombined plasmid.The recombinant plasmids picked out from positive clones were identified by PCR and then sequenced.Using the positive clones,the standards curve of target gene recombinant plasmids were constructed by real-time PCR.Results：The sequencing results were consistent with the objective genes and objective standard curves perfected could be received(R2>0.99).Conclusion：The plasmid standard for each target gene was successfully constructed.

Mitochondrial transcription factor A;Mitochondrial transcription factor B1;Mitochondrial transcription factor B2;Mitochondrial RNA polymerase;Plasmid standard;Real-time fluorescence quantitative PCR

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.03.030

四川省教育廳項目(13ZB0241)；南充市科技局項目(13A0054)

2015-09-21

羅德艷(1985-)，女，碩士，住院醫師。E-mail: lizhiluodeyan@163.com

馮俊，E-mail：flj20041201@163.com

時間：2016-6-1617∶46

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160616.1746.060.html

1005-3697(2016)03-00-0

R332

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