氟西汀作用于慢性溫和不可預見性應激大鼠海馬組織前后的差異蛋白質組學研究

顏因，曹莉莎，李敏，王繼生

(1.重慶市第九人民醫院，重慶　400700；2.綿陽市第三人民醫院，四川 綿陽　621000)

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氟西汀作用于慢性溫和不可預見性應激大鼠海馬組織前后的差異蛋白質組學研究

顏因1，曹莉莎2，李敏2，王繼生2

(1.重慶市第九人民醫院，重慶400700；2.綿陽市第三人民醫院，四川 綿陽621000)

目的：采用蛋白組學方法研究氟西汀對慢性溫和不可預見性應激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)大鼠海馬組織蛋白質表達的影響，以探討氟西汀抗抑郁的作用機制。方法：采用CUMS建立大鼠抑郁模型。造模完成后，氟西汀組給予氟西汀(3 mg/kg)灌胃給藥，每天1次，連續21 d。行為學實驗檢測大鼠抑郁行為的變化。提取的大鼠海馬組織蛋白質樣品經同位素標記相對和絕對定量標記、強陽離子柱分離、反相液相色譜分離、質譜分析，獲取的串聯質譜數據通過Protein.pilot 3.0軟件鑒定蛋白質，運用生物信息學分析差異表達的蛋白質功能。結果：共鑒定出5 109個蛋白質，41個差異表達的蛋白質，其中36個蛋白質表達上調，5個蛋白質表達下調，涉及氧化還原、信號傳導、合成代謝、對外界刺激壓力的反應等過程。結論：同時篩選到了四個可能與氟西汀抗抑郁作用密切相關的差異蛋白，分別是Neuronal calcium sensor 1(NCS-1)、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase zeta、Neurocan core protein和Sodium-and chloride-dependent GABA transporter，但這些蛋白在抑郁癥的發生、發展過程中的作用尚未完全清楚，需進一步深入研究。

氟西汀；抑郁；蛋白質組學；海馬組織；同位素標記相對和絕對定量

氟西汀是一種強效的、選擇性5-羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑，通過高度選擇性抑制突觸前膜對5-HT的再攝取而發揮抗抑郁作用。臨床上廣泛用于治療各種抑郁性精神障礙。雖然氟西汀的抗抑郁效果非常顯著，但也存在藥效延遲、部分抑郁患者療效不佳、復發率高等現象。氟西汀抗抑郁作用的關鍵蛋白及其啟動機制至今無明確報道，找到氟西汀作用的關鍵蛋白，明確其作用機制，對我們研究新型抗抑郁藥物有著至關重要的作用。

同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,ITRAQ)聯合液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)的方法是研究藥物作用的關鍵蛋白，發現蛋白標志物的強有力工具。該方法可同時對多達8種樣品進行定量研究，并且對低豐度蛋白檢測的靈敏度高，重復性好[1]。可同時分離和鑒定成百上千的蛋白質，最大化的獲得蛋白質的“全組信”[2]。本研究以ITRAQ1技術聯合LC-MS/MS技術分析氟西汀作用于慢性溫和不可預見性應激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)大鼠海馬組織后的差異表達蛋白，以進一步探討氟西汀抗議與作用過程中的關鍵蛋白及機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物

清潔級♂SD大鼠共40只，體重180～220 g,從重慶醫科大學實驗動物中心購買，合格證書編號SCXK(渝)2012-0001。實驗室環境溫度25 ℃，給予所有大鼠正常飲食飲水，實驗室內黑暗與光照交替出現，黑暗12 h，光照12 h，所有大鼠飼養1周適應環境。

1.2實驗試劑與儀器

H20(HPLC級別)(美國Sigma公司)，ITRAQ 標記試劑盒(美國Applied Biosystems公司)，BCA試劑盒(中國碧云天公司)，胰酶(美國Sigma公司)，Cocktail蛋白酶抑制劑(美國羅氏公司)，全蛋白提取試劑盒(上海生工)，蛋白裂解液(中國碧云天公司)，尿素(美國Sigma公司)，Anti-GABA Transporter(ab431)，聚偏氟乙烯膜(PVDF)0.45 μm(Merck Millipore,IPVH00010)，SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(5×)(碧云天生物技術研究所，P0015)，魯米諾化學發光液底物100 mL(Merck Millipore,WBLUC0100)，TBST緩沖液(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)，電泳/電轉儀(BIO-RAD公司，041BR88778)。曠場實驗行為測試儀，強迫游泳行為測試儀，高架十字迷宮(重慶醫科大學藥理實驗室制)。低溫冰箱(-20 ℃)(德國西門子)，Aallegra臺式高速冷凍離心機(美國Beckman Coulter公司)，超低溫冰箱(-80 ℃)(美國Thermo Fisher)，高效液相色譜儀(島津半制備型HPLC系統)，RVT4104低溫冷凍干燥器(美國Thermo Fisher)，SpeedVac真空離心器(美國Applied Biosystems公司)，MALDI/TOF/TOF5800蛋白分析儀及配套軟件Mascot軟件(美國Applied Biosystems公司)。

1.3實驗方法

1.3.1CUMS大鼠模型按照文獻方法[3]進行抑郁癥大鼠模型的復制。♂SD大鼠共40只，先進行曠場試驗評分，采用隨機區組設計，按曠場試驗結果將其分為正常組和模型組，每組20只。正常組正常飼養，模型組接受21 d各種不同溫和刺激，包括禁水24 h, 禁食24 h，4 ℃冰水游泳5 min，晝夜顛倒，熱刺激(45 ℃，5 min)，濕墊料，異味刺激，45°鼠籠傾斜24 h，每天隨機選擇一種刺激，相同刺激不得重復出現，同種刺激不能超過3次。

造模完成后，即第22天，進行曠場實驗、強迫游泳實驗、高架十字迷宮等行為學實驗以判斷造模是否成功。模型成功后，將模型組大鼠隨機分類兩組即氟西汀組和抑郁組，每組10只。氟西汀組給予氟西汀(3 mg/kg)灌胃給藥，抑郁組給予等體積生理鹽水，每天1次，連續21 d。實驗結束后，大鼠斷頸處死，冰臺上迅速分離出海馬組織，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存。

1.3.2海馬組織蛋白質的提取lysis buffer中加入5 μL磷酸酶抑制劑、1 μL蛋白酶抑制劑和10 mL 苯甲基磺酰氟(PMSF)混勻；冰上預冷玻璃勻漿器，2支lysis buffer；取凍存的大鼠海馬組織每組3只，PBS清洗，按組放入玻璃勻漿器，分別加預冷的lysis buffer，手動研磨，致均質勻漿；加入TCA-冰丙酮，-20 ℃沉淀2 h后，3 000 rpm,4 ℃，離心30 min,棄上清液，取沉淀。再加入丙酮，-20 ℃沉淀30 min，4 ℃，離心30 min，反復操作，至沉淀變為白色。-80 ℃凍存。

1.3.3ITRAQ標記蛋白溶解，定量：取凍存的兩組樣品，各加入40 mL裂解液和20 mL變性劑，震蕩混懸溶解，離心去除沉淀。用Bradford法進行蛋白定量，調整溶液的蛋白濃度，使每組蛋白樣品量為40 μg，體積20 μL；還原，封閉：按試劑盒提供方案進行還原、封閉；酶解：向各組蛋白溶液中加入1 μg胰酶，37 ℃溫育16 h；標記：各試管標記試劑中加入50 μL乙丙醇，混勻，分別加入各管樣品中，室溫反應1 h，之后各加入3倍體積水，使標記試劑分解。真空冷凍干燥；除鹽：將相關buffer和標記試劑的鹽除去。

1.3.4肽段的分離和鑒定(1)第一維強陽離子柱(SCX)分離：流動相A液：10 mMKH2PO4，25% CAN，pH=2.6；B 液：10 mMKH2PO4，350 mMKCl和25%ACN，pH=2.6。80 μL A液中溶解凍干樣品，上樣。將紫外檢測波長設置為214 nm/280 nm，然后將流速設置為200 μL/min。線性梯度洗脫：5～40 min，5%～25% B；40～45 min，25%～80% B；45～50 min，80% B；50～60 min，0%B。根據峰形和時間共收取20個梯度，真空離心濃縮后，每餾分用50 μL反相液相色譜的A相溶解，進樣量20 μL。(2)第二維反相液相色譜：流動相A液包含：5% (體積分數)乙腈和0.1% 甲酸溶液。流動相B液包含：95% 乙腈和0.1% 甲酸溶液。RPLC柱線性梯度洗脫：0～5 min，上樣； 5～70 min，5%～35% B；70～75 min， 35%～80% B；75～80 min，80% B； 80～81 min， 80%～5% B；90 min 停止。(3)質譜鑒定：噴霧針直接連接于反相色譜柱末端作為噴霧接口，噴霧電壓2.2 kV。MS掃描范圍：400～1 800 m/z，一個譜圖選擇4個最強母離子進行串級掃描，MS/MS掃描范圍100～2 000 m/z。

1.3.5生物信息學鑒定利用Protein.pilot 3.0軟件檢索質譜分析所得數據，差異蛋白篩選標準設定為：(1)肽段≥3；(2)模型組與正常組大鼠海馬組織蛋白分子質量比≥2.0或≤0.5；(3)P<0.05。運用Uniport軟件分析各蛋白生物學過程及分子功能，運用David軟件從生物過程，細胞成分，分子功能注釋對蛋白進行分類，選擇KEGG數據庫對蛋白所涉及的通路進行分類和富集分析。

1.3.6Western-blot驗證通過文獻檢索選擇了差異蛋白Sodium-and chloride-dependent GABA transporter 3進行Western-blot驗證。按照碧云天SDS-PAGE凝膠試劑盒提供配方制備凝膠；選取凍存大鼠海馬組織每組3只，提取蛋白并定量，調整每管蛋白濃度致均值，加入含2-巰基乙醇和溴酚藍的2×蛋白上樣緩沖液，100 ℃孵育10 min， 冷卻到室溫后，將變性蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內；蛋白上樣后電壓設置在100 V，時間設定為90～120 min，當溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳；然后經過轉膜，封閉，一抗孵育，二抗孵育，按1∶1加入AB顯影液，室溫放置5 min后，吸盡膜上水分，將膜放入暗盒，曝光5 min在Bio-Rad 的化學發光成像儀上顯影然后分析灰度值，再進行計算灰度系數比。

2　結果

2.1行為學實驗結果

根據前期的研究結果顯示[4]，21 d造模后，在曠場實驗中，模型組大鼠水平運動和垂直運動次數較正常組減少。在強迫游泳實驗中，模型組大鼠禁止不動時間較正常組增加。在高架十字迷宮實驗中，模型組大鼠進入開臂的次數及停留時間百分率明顯縮短，進入高架十字迷宮總次數明顯減少。說明CUMS致大鼠出現抑郁行為，模型建立成功。21 d氟西汀灌胃給藥后，氟西汀組大鼠抑郁行為得到明顯改善。

2.2ITRAQ實驗結果

本實驗基于ITRAQ技術聯合LC-MS/MS技術對氟西汀作用于CUMS大鼠后海馬組織內蛋白質表達的影響進行了差異分析。總共鑒定到5 109個蛋白，氟西汀組標記為119，模型組為121，設定蛋白豐度差異≥2.0倍(上調)；<0.5倍(下調)，且經統計檢驗其P<0.05為差異蛋白。共鑒定出差異蛋白41個，其中表達上調的蛋白有36個；表達下調的蛋白有5個，Uniport數據庫分析各個蛋白生物學過程及分子功能，見表1。

表1　Uniport數據庫分析各個蛋白生物學過程及分子功能

2.3生物學功能分析

通過David富集分析系統對41個差異蛋白進行GO分析和Pathway分析，通過GO分析發現這些蛋白共參與了29種生物學過程，31種細胞組分和17種分子作用，生物學進程分析(BP)分析發現差異表達蛋白主要參與了氧化還原、信號傳導、合成代謝、對外界刺激壓力的反應等。細胞成分分析(CC)分析得出差異蛋白廣泛分布在細胞膜、細胞質及細胞器內。分子功能分析(MF)分析得出這些蛋白的功能大多與離子束縛及核苷酸結合位點相關，見圖1。通過KEGG PATHWAY發現，共有19個蛋白參與了3條生物代謝通路。這3條通路分別是：檸檬酸循環、脂肪酸代謝及抗原加工提呈。

2.4Western-blot實驗結果

ITRAQ實驗結果顯示，蛋白Sodium-and chloride-dependent GABA transporter 3在氟西汀組大鼠海馬組織中表達下調，且比值為0.37。Western-blot實驗結果表明相對于CUMS大鼠海馬組織，蛋白Sodium- and chloride-dependent GABA transporter 3在氟西汀組大鼠海馬組織中明顯低表達。見圖2。

3　討論

有研究者發現氟西汀能夠增高CUMS大鼠海馬細胞神經生長因子(NGF)陽性表達。NGF在體內分布廣泛，具有營養神經元及促突起生長雙重生物學功能，NGF含量的高低與抑郁癥密切相關，這也可能是氟西汀抗抑郁的作用機制之一[5]。為深入探討氟西汀的抗抑郁作用機制，本實驗采用ITRAQ技術聯合LC-MS/MS技術分析氟西汀作用于CUMS大鼠后海馬組織蛋白的表達變化及這些差異表達蛋白與抑郁的關系。共鑒定出41個差異蛋白，其中表達上調36個，表達下調5個。通過GO分析發現這些差異蛋白主要參與了氧化還原、信號傳導、合成代謝及對外界刺激壓力的反應等生物學過程。通過KEGG發現這些差異蛋白總共參與3條代謝通路。這3條通路分別是：檸檬酸循環、脂肪酸代謝及抗原加工提呈。參與檸檬酸循環相關的主要的3個蛋白是Isocitrate dehydrogenase [NADP],Aconitate hydratase和Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase component of pyruvate dehydrogenase complex，這3個蛋白均是高表達，有利于檸檬酸循環的順利進行，保證機體的能量供應。kaibara等[6]發現該循環與抑郁癥的發生發展密切相關。參與脂肪酸代謝主要的3個蛋白是Enoyl-CoA delta isomerase 2，Trifunctional enzyme subunit alpha和Acetyl-CoA acetyltransferase，流行病學和飲食研究均顯示n-3系多元不飽和脂肪酸的缺乏與抑郁癥的發生和嚴重程度直接相關，而且存在反比關系[7]。本實驗發現參與脂肪酸代謝的這3個蛋白均高表達，但這些蛋白對脂肪酸代謝的影響及是否與抑郁癥的發生發展有關聯還待進一步研究。參與抗原加工提呈主要的3個蛋白是Calreticulin，Protein disulfide-isomerase A3和78 kDa glucose-regulated protein。均高表達。

結合GO分析，KEGG PATHWAY及Uniport分析結果發現4個差異蛋白可能與氟西汀抗抑郁作用密切相關。這4個蛋白是Neuronal calcium sensor 1(NCS-1)、Receptor-type tyrosine-protein phosphatase zeta、Neurocan core protein和Sodium- and chloride-dependent GABA transporter 3可能直接參與了氟西汀抗抑郁的過程。經蛋白質功能分析發現蛋白NCS-1參與了鈣離子跨膜運輸，負調節蛋白激酶活性，調節神經元投射等生物學過程。de Rezende 等[8]也發現NCS-1不足時能夠引起類似焦慮、抑郁等行為，并且會損傷小鼠的記憶力。Amici 等[9]也證實NCS-1在調節突出可塑性的初始部分信號通路中起著關鍵作用。Receptor-type tyrosine-protein phosphatase zeta與腦發育，學習記憶，海馬發育，軸突束狀，神經元發育，少突細胞分化，樹突發育，調控神經元死亡，神經元投射，監管纖維母細胞增值等有著密切的關系。有研究者發現大鼠額前皮質高親和力受體酪氨酸激酶蛋白的表達減少與腦卒中后抑郁的發生直接相關[10]。Neurocan core protein可以調節神經黏連和神經突觸的生長。Dimatelis 等[11]發現Neurocan core protein參與調節大鼠母嬰分離所帶來的焦慮及抑郁癥狀。蛋白Sodium- and chloride-dependent GABA transporter 3對GABA的運輸與鈉離子同向轉運活動密切相關，并且對其有高度的親和力，極易被再攝取到突觸前膜，終止GABA的活動，降低突觸間隙GABA的含量，加重抑郁。本研究發現氟西汀組大鼠海馬組織NCS-1、Neurocan core protein和Receptor-type tyrosine-protein phosphatase zeta表達遠遠高于抑郁組。而Sodium- and chloride-dependent GABA transporter 3的含量確遠遠低于抑郁組。與國內外研究人員所發表的結果相符合。

綜上所述，本研究通過ITRAQ技術聯合LC-MS/MS技術分析氟西汀抗抑郁作用機制，獲得了一系列與抑郁癥相關的差異表達蛋白，表明了該技術用于藥物抗抑郁蛋白質組學研究具有良好的前景。同時發現了氟西汀抗抑郁的一些重要蛋白，但這些蛋白在抑郁癥的發生、發展過程中的作用尚未完全清楚，需進一步深入分析。

[1]李敏,姜鵬,王淑萍,等.蛋白質組學在中藥研究中的應用[J].藥學實踐雜志,2013,31(4):76-82.

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[4]曹莉莎,羅文,王繼生,等.尼美舒利對慢性應激大鼠抑郁行為的影響[J].中國醫院藥學雜志,2014,34(11)：890-895.

[5]宋曉靈,張芳,王繼生,等.氟西汀對抑郁大鼠模型海馬CA1區CA3區及齒狀回區神經生長因子表達的影響[J].武漢大學學報,2015,36(2)：185-188.

[6]Kaibara T,Sutherland GR,Colbourne F,etal.Hypothermia: depression of tricarboxylic acid cycle flu x and evidence for pentose phosphate shunt upregulation[J].Journal of Neurosurgery,1999,90(2):339-347.

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[8]de Rezende VB,Rosa DV,Comim CM,etal.NCS-1 deficiency causes anxiety and depressive-like behavior with impaired non aversive memory in mice[J].Physiol Behav,2014,130(10):91-99.

[9]Amici M,Doherty A,Jo J,etal.Neuronal calcium sensors and synaptic plasticity[J].Biochem Soc Trans,2009,37(6):1359-1363.

[10]李云,郭旭,李永剛.腦卒中后抑郁大鼠額前皮質腦源性神經營養因子和酪氨酸激酶受體B蛋白的表達變化[J].中華行為醫學與腦科學雜志，2013，22(6)：507-509.

[11]Dimatelis JJ,Hendricks S,Hsieh J,etal.Exercise partly reverses the effect of maternal separation on hippocampal proteins in 6-hydroxydopamine-lesioned rat brain[J].Exp Physiol,2013,98(1):233-244.

(學術編輯：鄧世山)

Proteomics study of effects of fluoxetine on expression of proteins in hippocampus tissues of CUMS rats

YAN Yin1,CAO Li-sha2,LI Min2,WANG Ji-sheng2

(1.TheNinthPeople′sHospitalofChongqing,Chongqing400700;2.TheThirdPeople′sHospitalofMianyang,Mianyang621000,Sichuan,China)

Objective：The effects of fluoxetine on expression of proteins in hippocampus tissues of chronic unpredicted mild stress(CUMS) rats by proteomics study were studied to explore the anti-depression mechanism.Methods：CUMC was taken to establish rat depression model.Rats in fluoxetine group were administrated with fluoxetine (3 mg·kg-1·d-1) after stress procedure for 21 day .The extractd proteins from hippocampus tissues were digested by equal amount of trypsin and identified by ITRAQ coupled with the cation column and LC-MS/MS technology and then analyzed by Protein Pilot 3.0 search engine.Using bioinformatics to analyze differentially expressed proteins.Results：A total of 5109 proteins were identified,including 41 significantly differentially expressed proteins,which 5 proteins were down-regulated and 36 were up-regulated and involves redox reactions,signal transduction,anabolic metabolism,pressure to external stimuli of reaction process.Conclusion：Screening to four possible with fluoxetine antidepressant effect is closely related to the differences in protein,respectively is Neuronal calcium sensor 1 (NCS-1),Receptor-type tyrosine-protein phosphatase zeta,Neurocan core protein and Sodium- and chloride-dependent GABA transporter,but these proteins in the role in the process of the occurrence and development of depression is still not clear and need further study.

Fluoxetine;Depression;Proteomics;Hippocampus;Isobaric tags for relative and absolute quantification

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.03.014

四川省衛生廳科研課題(120320)

2016-01-06

顏因(1978-)，女，碩士，主治醫生。E-mail:yanyin616@sina.com通訊作者：曹莉莎，E-mail:285714739@qq.com

時間：2016-6-1617∶46

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160616.1746.028.html

1005-3697(2016)03-0336-06

R749.4

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