低劑量X線照射對破骨細胞分化及功能活性的作用機制

鄧曄坤,周曉中

(蘇州大學附屬第二醫院骨科，江蘇 蘇州　215004)

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低劑量X線照射對破骨細胞分化及功能活性的作用機制

鄧曄坤,周曉中

(蘇州大學附屬第二醫院骨科，江蘇 蘇州215004)

目的：探討低劑量X線照射(LDI)對破骨細胞的分化及功能活性的作用機制。方法：選擇RAW 264.7細胞株作為破骨前體細胞，誘導構建破骨細胞模型。將破骨細胞隨機分為對照組(0 cGy LDI)、照射組(10 cGy LDI)和P2X7-/-照射組(shRNA,10 cGy LDI)。采用生物發光試劑盒檢測各組培養基中三磷酸腺苷(ATP)的濃度，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色評估破骨分化成熟度，實時熒光定量逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)法檢測破骨細胞P2X7受體、組織蛋白酶K (cathepsin K)及基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)基因mRNA的表達情況。結果： LDI顯著提高了照射組和P2X7-/-照射組細胞基質中ATP的釋放，照射組中ATP分泌更加顯著。形態學實驗提示，LDI在一定程度上提高了破骨細胞的分化和骨吸收能力。與對照組比較，照射組P2X7受體及cathepsin K mRNA表達明顯升高，而P2X7-/-照射組明顯降低(P<0.05)；照射組MMP-9 mRNA表達與對照組比較無顯著差異(P>0.05)，而P2X7-/-照射組MMP-9 mRNA表達明顯降低(P<0.05)。結論：LDI通過ATP偶聯P2X7受體，從而提高破骨細胞的活性、分化及骨吸收能力。

低劑量X線照射；破骨細胞；三磷酸腺苷；P2X7受體

隨著醫療技術的普及，公眾及工作人員所承受的醫院內照射越來越多，對電離輻射的研究也越來越重要[1]。傳統認為，任何劑量的電離輻射對生物均有危害。近年來，多位學者[2-4]報道，低劑量的電離輻射與中高劑量電離輻射不同，其可誘發對生物有益的“興奮效應”。筆者所在單位的前期研究[5-7]已證實，低劑量X線照射(low-dose X-irradiation，LDI)可增強骨折處血管新生活動及骨痂礦化能力，并可在一定程度上促進成骨細胞和破骨細胞的分化，但其作用于破骨細胞的相關機制仍有待進一步研究。

刺激或創傷可引起胞膜內外三磷酸腺苷(adenosin triphosphate，ATP)發生變化，而電離輻射作用于生物體時，同樣會誘發類似的刺激[8]。ATP通過激活P2X7離子通道受體而對K+、Na+、Ca2+選擇性通透，而P2X7受體能通過激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號通路來調控生物活動。研究[9]已證實，MAPK信號通路和胞漿內Ca2+濃度分別調控破骨細胞的分化。本研究采用LDI干預破骨細胞，分析細胞外基質ATP及ATP偶聯P2X7受體的表達情況，旨在探討P2X7受體在LDI促進破骨細胞分化過程中的分子機制。

1　材料與方法

1.1實驗對象及分組

選取RAW 264.7細胞株(上海中科院生物細胞庫提供)作為破骨前體細胞，根據既往研究[7]方法成功誘導獲得破骨細胞，將誘導成功的穩定破骨細胞根據隨機數字表法分為對照組、照射組和P2X7-/-照射組。

1.2方法

1.2.1破骨細胞的誘導選取第3代狀態良好的RAW 264.7細胞，以2×104個/cm加入含有30 ng/mL的巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)和50 ng/mL的核因子kappa-B受體活化因子配體(receptor activator of NF-KB ligand，RANKL)的培養基中，誘導分化4～6 d[7]。

1.2.2P2X7-/-沉默模型的建立破骨細胞誘導后第6天，加入P2X7特異性shRNA[10]，靜置24 h，沉默效率>50%。

1.2.3照射條件美國Siemens公司直線加速器，X線照射，劑量率為2 Gy/min，總劑量為10 cGy，均為單次照射。

1.2.4各組破骨細胞胞外上清液中ATP釋放情況檢測成功誘導破骨細胞后6 d，更換各組細胞培養基，加入ATP酶抑制劑和ARL67156，培養30 min。照射組、P2X7-/-照射組給予LDI干預，靜置30 min后，使用ATP生物發光試劑盒(美國Sigma公司)檢測各組胞外上清液中ATP濃度。按照試劑盒說明書加樣，使用Luminometer模式檢測樣品發光。

1.2.5抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)檢測[11]使用TRAP試劑盒(美國Sigma公司)檢測各組破骨細胞的分化效率，成功誘導破骨細胞后4 d，LDI干預，并靜置24 h。按照試劑盒說明書漂洗并固定細胞，加入TRAP染液，37 ℃避光孵育1 h，蘇木素復染2 min，采用倒置相差顯微鏡觀察破骨細胞TRAP陽性細胞(≥3個細胞核的不規則細胞)。

1.2.6實時熒光定量逆轉錄多聚酶鏈反應(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測各組破骨細胞中P2X7受體、組織蛋白酶K(cathepsin K)及基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)基因mRNA的表達情況 成功誘導破骨細胞后6 d，LDI干預后靜置24 h。按Trizol法提取各組總RNA，合成cDNA，按照說明書進行PCR體系反應，并用Roche LightCycler? 480II自帶的軟件分析數據。引物由Invitrogen公司設計合成，引物序列見表1。

表1小鼠破骨細胞P2X7受體、cathepsin K、MMP-9和β-actin的引物序列

基因正向序列(5’-3’)反向序列(5’-3’)β-actinGACGGGGTCACCCACACTGTAGGAGCAATGATCTTGATCTTCP2X7受體TGCAGCTGGAACGATGTCTTGCGCTGGTACAGCTTATCGCTCACathepsinKCTGAAGATGCTTTCCCATATGT-GGGGCAGGCGTTGTTCTTATTCCGAGCMMP-9CGAGTGGACGCGACCGTAGTT-GGCAGGCTTAGAGCCACGACCATACAG

1.3統計學分析

2　結果

2.1LDI干預后30min各組細胞外上清液中ATP分泌比較

使用ATP生物發光試劑盒檢測各組破骨細胞在LDI干預后30min上清液中ATP的分泌情況，結果顯示：照射組(214.1±41.7)及P2X7-/-照射組(161.4±45.1)ATP分泌較對照組(37.3±11.2)明顯增多，其中照射組增加最為顯著(P<0.01)。見圖1。

2.2各組破骨細胞分化效率比較

倒置相差顯微鏡下可見，對照組和照射組生成的TRAP陽性細胞(細胞核≥3個)較多，P2X7-/-照射組生成的TRAP陽性細胞較少，其中照射組破骨細胞成熟度最高。見圖2。

2.3各組破骨細胞中P2X7受體、cathepsinK及MMP-9基因mRNA表達比較

與對照組(4.8±0.97；5.5±1.54)比較，照射組P2X7受體(15.9±2.21)及cathepsinK(13.1±1.87)mRNA表達明顯升高(P<0.01)，而P2X7-/-照射組(3.2±1.01；4.1±0.83)則降低；照射組MMP-9(17.1±2.05)mRNA表達與對照組(16.5±2.30) 比較無顯著差異(P>0.05,P=0.172)，而P2X7-/-照射組MMP-9(5.2±1.35)mRNA表達明顯降低(P<0.01)。見圖3。

3　討論

前期研究[6-7]已證實，低劑量射線照射可促進破骨細胞的分化與成熟，與張忠新等[2]、劉樹錚[3]的報道相似。作為一種能量較低的電離輻射，低劑量X射線具有機械刺激的特性。本實驗進一步證實，低劑量射線照射通過促進細胞釋放ATP，而使胞外ATP濃度增加，同時胞漿中的ATP可激活P2X7受體，進一步促進ATP釋放(圖1)。

P2X7受體是P2X嘌呤能受體家族的一個亞型，是一種非選擇性配體門控離子通道，可介導細胞間的快速信息傳遞，廣泛調控許多生理機能，包括細胞增殖與分化、功能的獲得與喪失以及細胞凋亡等[12]。張秀軍等[13]發現，外周單核細胞和破骨細胞中存在P2X7受體表達。Ohlendorff等[14]認為，P2X7受體可誘導破骨細胞和成骨細胞的凋亡；當P2X7受體存在缺陷時，骨折風險將增加。也有學者[15]報道，P2X7受體可激活MAPK信號通路和激活T細胞核因子(nuclearfactoractivatedTcell，NFAT)信號通路，從而促進破骨細胞的分化。本實驗發現，照射組的破骨細胞分化成熟度較對照組和P2X7-/-照射組明顯增高，而P2X7-/-照射組的破骨細胞分化極少，說明低劑量射線照射可能通過介導P2X7受體來調控破骨細胞的分化和成熟。P2X7-/-照射組cathepsinK及MMP-9基因mRNA表達較對照組明顯減少，從另一方面說明了P2X7受體對低劑量射線促進破骨細胞分化及骨吸收的介導作用。此外，照射組中P2X7受體mRNA表達明顯多于對照組，進一步說明低劑量射線照射能促進細胞釋放ATP，激活P2X7受體。

在成骨細胞增殖分化中，低劑量射線照射能激活PI3K/Akt信號通路，并級聯激活MAPK/細胞外信號調節激酶(extracellularsignal-regulatedproteinkinase，ERK)蛋白，進一步激活下游核因子kappa-B(nuclearfactorkappa-B，NF-КB)、糖原合成酶激酶(glycogensynthasekinase3，GSK3)及Runx2等蛋白，從而調控成骨分化過程，初步證實了低劑量射線照射促進骨痂礦化和骨折愈合的分子機制[16]。本研究進一步證實了低劑量照射促進破骨細胞分化中P2X7受體的介導作用，是對低劑量射線促進骨愈合系列研究的深入補充。但關于低劑量射線照射激活P2X7受體、MAPK信號通路，級聯激活下游功能蛋白，并介導破骨細胞分化與發揮骨吸收功能的具體機制仍需進一步研究證實。

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(學術編輯：陳路)

Action mechanism of low-dose X-irradiation on osteoclast differentiation and functional activity

DENG Ye-kun,ZHOU Xiao-zhong

(DepartmentofOrthopaedics,theSecondHospitalAffiliatedtoSoochowUniversity,Suzhou215004,Jiangsu,China)

Objective：To explore the action mechanism of low-dose X-irradiation (LDI) on osteoclast differentiation and functional activity.Methods：RAW 264.7 cell lines were selected as osteoclast precursors,and they were induced to establish osteoclast models.The osteoclasts were randomly assigned into control group (0 cGy of LDI),irradiation group (10 cGy of LDI) and P2X7-/-irradiation group (shRNA and 10 cGy of LDI).The concentration of adenosin triphosphate (ATP) in culture medium of each group was detected using bioluminescence kit.The maturity of osteoclast differentiation was evaluated by tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining,and expressions of P2X7receptor,cathepsin K and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) gene mRNA were determined using real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).Results：LDI significantly improved the release of ATP in cell matrix in irradiation group and P2X7-/-irradiation group,and ATP secretion increased markedly in irradiation group. Morphological experimental results indicated that LDI could improve the capabilities of osteoclast differentiation and bone resorption to some extent.When compared with control group,the mRNA expressions of P2X7receptor and cathepsin K in irradiation group elevated dramatically,whereas those in P2X7-/-irradiation group decreased obviously (P<0.05).No significant difference was shown between irradiation group and control group by comparison to MMP-9 mRNA expression (P>0.05),but the MMP-9 mRNA expression in P2X7-/-irradiation group decreased evidently (P<0.05).Conclusion：LDI can improve the capabilities of osteoclast activity,differentiation and bone resorption by ATP coupling P2X7receptor.

Low-dose X-irradiation;Osteoclast;Adenosin triphosphate;P2X7receptor

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.03.034

2016-01-18

鄧曄坤(1985-)，男，碩士，醫師。E-mail：dengyk_mu@163.com通訊作者：周曉中，E-mail: zhouxz@suda.edu.cn

時間：2016-6-1617∶46

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160616.1746.068.html

1005-3697(2016)03-0407-04

R814.2；R329.28

A