強(qiáng)的松增強(qiáng)HBV感染小鼠體內(nèi)病毒復(fù)制表達(dá)

于毅，劉鳳君，石瑤,3，陸明嬌，魏小麗

(1. 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科,四川 南充　637000；2 達(dá)州市人民醫(yī)院感染科,四川 達(dá)州　635000；3.成都市第三人民醫(yī)院內(nèi)科，四川 成都　610000)

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強(qiáng)的松增強(qiáng)HBV感染小鼠體內(nèi)病毒復(fù)制表達(dá)

于毅1，2，劉鳳君1，石瑤1,3，陸明嬌1，魏小麗1

(1. 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科,四川 南充637000；2 達(dá)州市人民醫(yī)院感染科,四川 達(dá)州635000；3.成都市第三人民醫(yī)院內(nèi)科，四川 成都610000)

目的：檢測糖皮質(zhì)激素對HBV感染小鼠體內(nèi)HBV復(fù)制的作用。方法：采用高壓注射體內(nèi)轉(zhuǎn)染法將HBV復(fù)制型重組質(zhì)粒pAAV /HBV1.2導(dǎo)入雄性C57BL/6小鼠，轉(zhuǎn)染后24 h按體重、年齡、血清HBeAg水平對小鼠進(jìn)行配對，分為實(shí)驗(yàn)組和對照組,分別連續(xù)給予強(qiáng)的松或生理鹽水灌胃。于第3天和第10天給藥后4～6 h處死小鼠。采用Southern雜交檢測小鼠肝臟HBV-DNA復(fù)制中間體；化學(xué)發(fā)光法檢測血清中HBeAg和HBsAg。結(jié)果：對HBV感染小鼠連續(xù)給予強(qiáng)的松或生理鹽水3 d后，所有小鼠肝臟中均可檢測到較高水平的HBV-DNA復(fù)制中間體，給予強(qiáng)的松的實(shí)驗(yàn)組稍高于給予生理鹽水的對照組，二者比值為1.127∶1；連續(xù)處理10 d后，實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟中HBV-DNA復(fù)制中間體的水平明顯高于對照組，比值為2.534∶1。處理3 d后對照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠血清HBsAg平均值分別為：1 618.28 μg/μL、1 666.23 μg/μL，實(shí)驗(yàn)組與對照組無明顯差別；小鼠血清對照組和實(shí)驗(yàn)組HBeAg平均值分別為14.68μg/μL、14.95 μg/μL，實(shí)驗(yàn)組對照組無明顯差別；處理10 d后對照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠血清HBsAg平均值分別為：8 059.40 μg/μL、11 885.87 μg/μL，實(shí)驗(yàn)組高于對照組。小鼠血清對照組和實(shí)驗(yàn)組HBeAg平均值分別為183.15 μg/μL、286.14 μg/μL，實(shí)驗(yàn)組高于對照組。結(jié)論：強(qiáng)的松可增強(qiáng)HBV感染小鼠體內(nèi)乙肝病毒的復(fù)制和表達(dá)，并且隨著作用時間的延長，作用也越明顯。本研究為糖皮質(zhì)激素及引起HBV再激活的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)，同時也再次提醒臨床醫(yī)生，應(yīng)充分重視糖皮質(zhì)激素的使用中HBV再激活的問題。

強(qiáng)的松；乙型肝炎病毒；復(fù)制；小鼠模型；高壓注射體內(nèi)轉(zhuǎn)染法

乙肝病毒(hepatitis B Virus, HBV)感染是一個全球性的公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重危害著乙肝患者的健康，在發(fā)展中國家尤為嚴(yán)重。據(jù)2006年我國流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，1～59歲的一般人群HBsAg攜帶率為7.18% ，5歲以下兒童的HBsAg攜帶率為0.96%[1-2]。據(jù)此估計，我國現(xiàn)有的慢性HBV感染者約9 300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2 000萬例[3]。

免疫抑制劑在臨床醫(yī)療中被廣泛應(yīng)用，如在自身免疫性疾病、器官移植、腫瘤化療、哮喘以及某些感染性疾病的治療中具有不可替代的作用。然而，該類疾病患者中常有部分患者合并HBV感染。臨床研究發(fā)現(xiàn)：使用免疫抑制劑可引起HBV感染者病毒再激活而引起肝功能損害，甚至出現(xiàn)肝功能衰竭[4-5]。在所有免疫抑制劑中，糖皮質(zhì)激素是引起HBV再激活并導(dǎo)致肝臟損害的高危因素。通過兩種機(jī)制可增強(qiáng)HBV的復(fù)制，一是抑制機(jī)體的免疫功能,二是直接激活HBV的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。但其激活HBV的具體機(jī)制以及如何引起肝臟損害的機(jī)制尚未完全闡明。本研究擬進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，檢測糖皮質(zhì)激素對HBV轉(zhuǎn)錄復(fù)制的影響進(jìn)行體內(nèi)研究，為上述機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

HBV屬于嗜肝DNA病毒家族，具有嚴(yán)格的宿主特異性。在有關(guān)HBV研究的動物模型中，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)成為HBV研究領(lǐng)域公認(rèn)的模型[6],但是轉(zhuǎn)基因小鼠的建立技術(shù)要求很高，價格昂貴且先天免疫耐受，難以應(yīng)用HBV感染免疫學(xué)方面的研究。本研究小組曾通過高壓尾靜脈法將HBV復(fù)制型質(zhì)粒pHBV4.1導(dǎo)入BALB/C小鼠建立了乙型肝炎病毒復(fù)制型小鼠模型，同時用該模型檢測到臨床多種抗病毒藥物對HBV的抑制作用，但是該模型為一短期HBV感染模型，HBV復(fù)制表達(dá)的持續(xù)時間僅為10 d[7-9]。2006年臺灣大學(xué)陳培哲等報道將腺相關(guān)病毒作載體的HBV復(fù)制質(zhì)粒pAAV/HBV1.2通過高壓尾靜脈注射的方法導(dǎo)入C57BL/6品系小鼠，成功的建立了HBV慢性感染的小鼠模型。該小鼠模型體內(nèi)HBV的復(fù)制表達(dá)可持續(xù)6個月以上，與人類慢乙肝患者極為相似[10]。本研究小組有幸得到陳培哲教授惠贈的pAAV/HBV1.2質(zhì)粒，因此擬采用該質(zhì)粒建立該HBV慢性感染小鼠模型，初步研究強(qiáng)的松對小鼠體內(nèi)HBV的影響，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1主要材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物雄性C57BL/6小鼠購自重慶滕鑫生物有限公司(SPF級)，6～9周齡、體重20～22 g。

1.1.2實(shí)驗(yàn)材料重組質(zhì)粒pAAV/HBV1.2由臺灣醫(yī)科大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室陳培哲教授惠贈；質(zhì)粒DNA 抽提純化試劑盒Qiagen-Tip 500 購自QIAGEN 公司；蛋白酶、DNaseⅠ、魚精DNA 等購自Sigma 公司；地高辛探針標(biāo)記試劑和化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自Roche 公司；強(qiáng)的松購自浙江仙據(jù)制藥股份有限公司(批號：110681)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1質(zhì)粒制備將pAAV/HBV1.2質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109, 擴(kuò)增、提取及純化采用QIAGEN TIP-500,操作按試劑盒說明書的程序進(jìn)行。

1.2.2動物實(shí)驗(yàn)將質(zhì)粒DNA10 μg用生理鹽水稀釋，注射液體的總量為小鼠體重的8%，采用高壓尾靜脈轉(zhuǎn)染法將質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠體內(nèi)(注射過程在5～8 s內(nèi)完成)[7]。高壓注射后24 h自小鼠眶靜脈采血，檢測血清HBeAg，按小鼠體重、年齡、血清HBeAg水平配對，分為試驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組給予強(qiáng)的松200 μg(溶于200 mL生理鹽水)灌胃，每日1次(該劑量由預(yù)實(shí)驗(yàn)所得，可以激活小鼠體內(nèi)HBV的表達(dá)，又保證小鼠較高的存活率)。對照組給予同等劑量生理鹽水灌胃。分別于第3天和第10天最后一次給藥后4～6 h處死小鼠，留取小鼠的血清和肝臟。血清保存于-20 ℃，肝組織迅速置入液氮冷凍，然后-70 ℃保存。

1.2.3小鼠肝組織HBVDNA復(fù)制中間體的提取及檢測分析 將凍存的肝組織在液氮中碾成粉末，用于提取HBV DNA復(fù)制中間體。取30 μL HBV DNA溶液以10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，用Southern雜交檢測HBV DNA復(fù)制中間體，雜交采用地高辛標(biāo)記的全長HBV基因組。采用化學(xué)發(fā)光法檢測雜交結(jié)果，具體操作按以前的方法進(jìn)行[7]。將雜交結(jié)果的膠片經(jīng)灰度掃描，用Quantity One 4.6軟件對結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

1.2.4化學(xué)發(fā)光法檢測小鼠血清HBV相關(guān)抗原分別取50 μL血清采用化學(xué)發(fā)光法檢測HBV表面抗原(HBV surface antigen,HBsAg)和HBV e抗原(HBeAg)，抗原的檢測采用雅培i-2000自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑盒檢測，具體操作按說明書進(jìn)行。

2　結(jié)果

2.1強(qiáng)的松對小鼠體內(nèi)HBV復(fù)制的影響

如圖1和圖2所示，對HBV感染小鼠連續(xù)給予強(qiáng)的松或生理鹽水3 d后，所有小鼠肝臟中均可檢測到較高水平的HBV 制中間體DNA，給予強(qiáng)的松的實(shí)驗(yàn)組稍高于給予生理鹽水對照組，經(jīng) Quantitiy One分析，二者比值為1.127∶1(圖1和圖2)。而連續(xù)給予強(qiáng)的松或生理鹽水10 d后，實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟中HBV 復(fù)制中間體 DNA 的水平明顯高于對照組，為對照組的 2.534倍 (圖3和圖4)。

生理鹽水(NS)為對照組，強(qiáng)的松(prednisone)為實(shí)驗(yàn)組; RC DNA (relaxed circular DNA)為雙股鏈松弛環(huán)狀DNA，SS DNA(single-strandde DNA)為單鏈DNA。

2.2強(qiáng)的松對小鼠體內(nèi)HBV抗原表達(dá)的影響

2.2.1強(qiáng)的松處理3 d對小鼠體內(nèi)HBV抗原標(biāo)的影響如圖5所示：處理3 d后對照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠血清HBsAg平均值分別為：1618.28 μg/μL、1666.23 μg/μL，實(shí)驗(yàn)組與對照組無明顯差別；實(shí)驗(yàn)組與對照組小鼠血清中HBeAg也無明顯差別，其平均值分別為14.68 μg/μL、14.95 μg/μL。

2.2.2強(qiáng)的松處理10 d對小鼠體內(nèi)HBV抗原標(biāo)的影響給與強(qiáng)的松處理10 d后對照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠血清HBsAg平均值分別為：8059.402 μg/μL、11885.868 μg/μL，實(shí)驗(yàn)組高于對照組。處理10 d后小鼠血清對照組和實(shí)驗(yàn)組平均值分別為183.15 μg/μL、286.136 μg/μL，實(shí)驗(yàn)組也高于對照組(圖6)。

3　討論

糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用使免疫相關(guān)疾病的預(yù)后得到明顯改善，而在這些患者中，常有部分存在HBV感染者未受到醫(yī)生的重視而隨著糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用出現(xiàn)了HBV再激活，肝損導(dǎo)致原有治療的中斷，甚至出現(xiàn)肝衰竭死亡。早在1975年,Wands等[11]就首先報道20例患淋巴瘤、骨髓增殖性疾病合并HBV攜帶的患者在化療時使用免疫抑制劑(特別是糖皮質(zhì)激素)中出現(xiàn)HBV復(fù)發(fā), 表現(xiàn)為肝功能急劇損傷，自此后漸漸引入了HBV再激活的概念。HBV再激活是指在化療和(或)免疫抑制治療期間，或緊隨其后發(fā)生的HBV DNA定量升高10倍以上或其絕對值>109 copies/mL[12]。此后，國內(nèi)外陸續(xù)有研究者相繼報道，Cheng等[13]對非霍奇金淋巴瘤患者采用含激素與不含激素方案化療，比較乙肝病毒激活發(fā)生率，結(jié)果提示含激素組HBV再激活發(fā)生率顯著增高。譚競等[14]回顧性分析了46例患有不同基礎(chǔ)疾病但均需使用免疫抑制劑的HBV感染者的臨床資料，發(fā)現(xiàn)不論其基礎(chǔ)疾病如何，糖皮質(zhì)激素及化療藥物(蒽環(huán)類、環(huán)磷酰胺等)均易引起HBV再激活，其中6例發(fā)生重癥肝炎的患者均使用過糖皮質(zhì)激素。陳彥帆等[15]研究者應(yīng)用二值多元logistic回歸模型對HBV再激活的高危因素進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)使用激素與蒽環(huán)類是HBV激活的高危因素，這與Yeo 等[16]報道淋巴瘤、乳腺癌患者 HBV激活率高是由于這些腫瘤患者的化療方案中一般都含有蒽環(huán)類和皮質(zhì)類固醇類藥物的理論相一致。以上資料均提示，糖皮質(zhì)激素是HBV再激活并引起肝損的高危因素。

根據(jù)目前研究報道，關(guān)于免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素引起HBV感染者肝臟損傷的機(jī)制的觀點(diǎn)均支持免疫抑制劑先引起HBV載量升高，待免疫功能恢復(fù)后出現(xiàn)肝損。但這不能完全解釋在應(yīng)用糖皮質(zhì)激素過程中，患者仍處于免疫抑制階段發(fā)生的肝損，這還需要進(jìn)一步研究。另外，為了避免肝損的出現(xiàn)，目前主張抗病毒治療。關(guān)于給予抗病毒治療的時間，多數(shù)人主張在使用免疫抑制劑前一周，但缺乏基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)支持。而且能否將提前的時間縮短，尚無證據(jù)回答，而縮短的時間對某些疾病的療效、預(yù)后可能具有非常重要的意義，這也需要研究進(jìn)行探索。本研究擬在小鼠體內(nèi)觀察糖皮質(zhì)激素對HBV復(fù)制的影響，為深入的研究奠定基礎(chǔ)。

本研究通過對使用高壓注射法建立的HBV感染小鼠模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，給予強(qiáng)的松處理后，小鼠血清中HBV載量和HBV抗原水平表達(dá)明顯增高，且隨著用藥時間的延長，其增強(qiáng)作用愈明顯。這提示強(qiáng)的松對HBV感染小鼠體內(nèi)的病毒的復(fù)制、表達(dá)均有增強(qiáng)作用，且隨著時間的延長，作用越明顯。這與臨床觀察結(jié)果及很多文獻(xiàn)報道一致。

總之，本研究在HBV感染小鼠體內(nèi)檢測到強(qiáng)的松對乙肝病毒的復(fù)制和表達(dá)的增強(qiáng)作用，且隨著時間愈長增強(qiáng)作用愈明顯，為糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑引起HBV再激活的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。同時也再次提醒臨床醫(yī)生，尤其是非感染專業(yè)醫(yī)生應(yīng)充分重視糖皮質(zhì)激素的使用中HBV再激活的問題。

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(學(xué)術(shù)編輯：周仲輝)

Prednisone enhancing viral replication and expression in HBV transfection mice

YU Yi1,2,LIU Feng-jun1,SHI Yao1,3，LU Ming-jiao1，WEI Xiao-li1

(1.DepartmentofInfection,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000；2.DepartmentofInfection，DazhouPeople′sHospital,Dazhou635000；3.InternalMedicine,TheThirdPeople′sHospitalofChengdu,Chengdu610000,Sichuan,China)

Objective：To detect the effect of glucorticoid on HBV replication of mice in vivo.Methods：HBV replication competent plasmid pAAV/HBV1.2 was transferred into male C57L/6 mice by hydrodynamics-based in vivo transfection.24 h after transfection,the mice were matched by body weight, age and serum level of Hepatitis B e antigen (HBeAg) and were divided into experiment group and control group,and then treated orally with prednisone or normal saline at interval of twenty four hours for 3 and 10 days.Four to six hours after the last administration, the mice were killed.HBV-DNA replication intermediates in liver were analyzed by Southern Blot Hybridization.The serum HBsAg and HBeAg were detected by chemiluminescent detection system. Results：HBV-DNA replication intermediates were detected in the livers of mice after treating orally with prednisone or normal saline for 3 days,the level of HBV-DNA replication intermediates of the experimental group was 0.127 times higher than that of the control group.However,after treatment for 10 days,compared with the control group of mice,the level of HBV-DNA replication intermediates of the experimental mice increased greatly.Quantitative analysis showed that prednisone enhanced the level of HBV-DNA replication intermediates appropriately 1.534 fold. Three days after the above treatment,the serum HBsAg of the control mice and the experimental mice were 1 618.28 μg/μL and 1 666.23 μg/μL on average respectively,which showed no significant difference.Similarly,there was no significant difference in the serum HBeAg,which showed as follows:14.68 μg/μL,14.95 μg/μL on average respectively.In contrast,10 days after the same treatment,the serum HBsAg of the control and the experimental of mice were on average 8 059.40 μg/μL,11 885.87 μg/μL,respectively,and the serum HBeAg were 183.15 μg/μL,286.14 μg/μL,respectively.Both of the level of serum HBsAg and HbeAg from experimental mice were higher than that of control animals.Conclusion：The replication and expression of hepatitis B virus in the HBV infection mice could be increased by prednisone orally and the increasing effect of prednisone on HBV is time-dependant,which provides further research about HBV reactivation caused by prednisone and other immunosuppressive drugs,and reminds clinicians,especially non-infected professional doctors to pay full attention to HBV reactivation when glucocorticoid is used in patients with HBV infection.

Prednisone;Hepatitis B virus;Replication;Mouse model;Hydrodynamics-based in vivo transfection

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.03.013

四川省衛(wèi)生廳項目(100150)

2015-08-09

于毅(1977-)，男，碩士，主治醫(yī)師。通訊作者：劉鳳君，E-mail: lfj116@126.com

時間：2016-6-1617∶46

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160616.1746.026.html

1005-3697(2016)03-0331-05

R512.6

A