去鐵胺減少老年大鼠急性腦出血后神經元凋亡作用及其機制

常遠,王敏娟

(1.西安醫學院臨床醫學院,陜西 西安　710021;2.西安醫學院第一附屬醫院 老年病科,陜西 西安　710077)

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去鐵胺減少老年大鼠急性腦出血后神經元凋亡作用及其機制

常遠1,王敏娟2

(1.西安醫學院臨床醫學院,陜西 西安710021;2.西安醫學院第一附屬醫院 老年病科,陜西 西安710077)

目的：探討去鐵胺(deferoxamine,DFX)降低急性腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)誘導的神經元凋亡作用及其機制。方法：雄性SD大鼠右側基底節區尾殼核注射100 μL自體全血，隨機分為觀察組和對照組。觀察組ICH后2 h注射DFX，以后每12 h注射一次，直至7 d；對照組注射等量生理鹽水(normal saline,NS)。兩組均在ICH后1、3、7 d進行行為學檢測，并檢測血腫大小、神經元凋亡、鐵蛋白、血漿鐵蛋白水平。結果：觀察組ICH后7 d前肢放置明顯恢復(P<0.01)，ICH后3、7 d右轉百分比明顯降低(P<0.01)；ICH后7 d，觀察組血腫分辨率明顯降低(P<0.01)；ICH后1 d，觀察組TUNEL陽性細胞數顯著降低(P<0.05)，但ICH后3 d，兩組TUNEL陽性細胞數差異無統計學意義(P>0.05)；觀察組鐵蛋白重鏈和輕鏈表達顯著減少(P<0.05)；血漿鐵蛋白水平在ICH后3、7 d有所降低，但與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。結論：DFX緩解老年大鼠急性ICH后神經細胞凋亡及神經功能缺損，可能是通過影響急性ICH的內源性反應而發揮保護作用。

急性腦出血;去鐵胺;凋亡;老年鼠

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是一種常見的卒中類疾病，通常導致嚴重的神經功能損傷，盡管過去20年在卒中治療方面已取得較大進步，但ICH后30 d內死亡率并未明顯降低[1]。目前降壓治療成為ICH急性期最主要的治療方法[2]，但過度降壓可導致急性腦缺血，加劇ICH后腦損傷[3]。據報道[4]，鐵螯合劑去鐵銨(deferoxamine，DFX)可減少年輕大鼠ICH或血紅蛋白誘導的腦水腫、神經元死亡、神經功能缺損和腦萎縮。但ICH主要是老年疾病，年齡也是ICH后腦損傷的主要因素。有研究[5]發現，DFX可降低老年大鼠ICH后行為障礙和腦萎縮，但其對老年大鼠ICH后神經元損傷的影響未見相關報道。本研究評價了DFX對老年大鼠ICH后神經元凋亡及內源性反應的影響，旨在探討DFX減少ICH后腦損傷作用及其機制。

1　材料與方法

1.1材料

40只雄性SD大鼠(由西安醫學院第一附屬醫院動物中心提供)，12個月，體質量250～300 g，自由飲水攝食，飼養溫度20～30℃。

動物腦立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司)；注射用DFX(瑞士諾華制藥有限公司，注冊證號H20091034)；TUNEL凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；鐵蛋白酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)；鐵蛋白重鏈(ferritin heavy chain, FTH)抗體、骨骼肌蛋白FHL抗體(美國Sigma公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠ICH模型制備及分組術前8 h禁食，不禁水，水合氯醛35 mg/kg腹腔注射麻醉，立體定位儀固定，頭部正中縱形切口，暴露前囟和冠狀縫，冠狀縫前0.2 cm、中線旁開0.4 cm處用直徑1 mm牙鉆鉆開顱骨至硬腦膜，將靜脈留置針垂直插入腦尾殼核內。用溫水加溫鼠尾，待充血后乙醇消毒，距尾部2 cm處剪斷鼠尾，用微量注射器取未凝血100 μL，2 min內均勻注入右側基底節區尾殼核內。術后用骨蠟封閉顱骨創口，縫合皮膚[6]。將大鼠隨機分為觀察組和對照組，各20只。觀察組在ICH后2 h肌肉注射DFX 100 mg/kg，以后每12 h注射一次，直至7 d，對照組注射等量生理鹽水(normal saline，NS)。

1.2.2行為學檢測ICH前及ICH后1、3、7 d進行行為學檢測。①前肢放置實驗：使用撩撥觸須引發前肢放置而進行評分，記錄每個前肢通過每次撩撥同側觸須引發同側肢體放置桌面的次數，重復測量10次。②轉角實驗：將大鼠放入30°角落里，大鼠通過左轉或右轉才能走出角落，記錄其向兩側轉身的次數。重復10次，每次測驗間隔至少30 s，計算右轉的比例。

1.2.3血腫體積ICH后1、3、7 d，處死大鼠，冷凍大腦并切片。起始于前囟2 mm，延伸至后面4 mm，20 μm切片，HE染色并掃描。Image J軟件檢測血腫輪廓，重復3次，取均值。

1.2.4TUNEL染色ICH后1、3 d，采用原位細胞凋亡檢測試劑盒的過氧化物酶DNA碎片評估。步驟如下：組織切片，附在載玻片上，4%多聚甲醛固定ProteinK，滴加50 μL的TdT酶反應液于樣本區域上，37 ℃、潮濕環境中反應60 min；POD 1 h，37 ℃、避光；PBS浸洗3次，每次5 min；于載玻片的樣本區域滴加100 μL DAB工作液(直到呈現淺棕色背景)；去離子水漂洗2～3次，滴加幾滴甘油于樣本區域，蓋上蓋玻片進行封片，即刻在光學顯微鏡下進行觀察并拍照。

1.2.5Western blot分析ICH后7 d，取出大鼠右側基底節區尾殼核腦組織，按10 mL/g比例加入全細胞裂解液。勻漿、超聲破碎，待細胞全部溶解后。BCA法進行蛋白定量，加入Loading Buffer制備成電泳樣品，10%凝膠電泳，PVDF轉膜，10%脫脂牛奶封閉1 h。加FTH、FTL抗體(1∶1 000)室溫下孵育3 h，加入1∶5 000的辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG中，孵育1 h。棄二抗，根據ECL試劑盒的反應步驟，得到顯示特異蛋白條帶的X光片。所得X-光膠片結果用Gel Doc凝膠成像分析系統掃描，并應用Quantity One軟件進行半定量分析。

1.2.6免疫組化檢測ICH后7 d，麻醉大鼠，4%多聚甲醛灌注，取出鼠腦，4%多聚甲醛固定過夜后，30%蔗糖浸泡3～4 d，4 ℃脫水，OCT包埋，20 μm切片，免疫組化染色用，一抗為多克隆兔抗人鐵蛋白IgG，二抗為生物素標記的山羊抗兔IgG，正常兔IgG作為陰性對照。

1.2.7血漿鐵蛋白檢測ICH后1、3、7 d，麻醉大鼠，取全血，采用鐵蛋白ELISA試劑盒檢測血漿鐵蛋白水平。

1.3統計學分析

采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，定量資料以均數±標準差描述，組間比較采用t檢驗或基于秩次的重復測量方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1ICH后行為學檢測

對照組前肢放置未見好轉，而觀察組ICH后7 d前肢放置明顯恢復(3%/25%，P<0.01)，見圖1A；轉角實驗中，觀察組在ICH后3 d(95%/83%，P<0.05)、7 d(90%/75%，P<0.05)右轉百分比明顯降低，見圖1B。

2.2血腫體積變化

ICH后1、3d，觀察組和對照組血腫體積無統計學差異(P>0.05)；ICH后7 d，觀察組血腫體積增加(4 mm3/15mm3，P<0.01)。見圖2。

2.3ICH誘導神經元凋亡

ICH后1 d，觀察組TUNEL陽性細胞數顯著降低(298/mm2vs 145/mm2，P<0.05)；ICH后3 d，觀察組和對照組TUNEL陽性細胞數差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

2.4ICH后內源性鐵蛋白變化

Western blot結果顯示，DFX處理會顯著減少鐵蛋白重鏈(3 480/2 450，P<0.05)和輕鏈表達(3 460/2 000，P<0.05)，見圖4。

2.5ICH后血漿鐵蛋白水平

觀察組血漿鐵蛋白水平在ICH后3、7 d有所降低，分別為(282±62)ng/mL、(335±79)ng/mL，對照組分別為(630±730)ng/mL、(559±439)ng/mL，兩組差異無統計學意義(P>0.05)。

3　討論

紅細胞溶解和鐵的毒性有助于ICH后腦損傷[7]。鐵蛋白是自然產生的鐵螯合劑，參與腦內鐵穩態的維持。鐵蛋白由2個亞型組成：重鏈和輕鏈。重鏈和輕鏈具有不同的功能，重鏈具有亞鐵氧化酶活性，催化可溶的二價鐵離子氧化不溶的三價鐵離子；而輕鏈參與鐵核心的形成，礦化作用及鐵的長期儲存[8]。ICH患者血清鐵蛋白水平與血腫周圍水腫體積及預后具有相關性[9]。但DFX對鐵蛋白上調和血腫清除激活等ICH內源性反應的影響目前尚不清楚。

本研究發現，DFX治療能夠改善老年大鼠ICH模型神經元凋亡和神經功能障礙，提示鐵螯合療法可用于治療急性期的腦出血。DFX也影響到ICH引起的內源性反應，抑制鐵蛋白上調并延緩老年大鼠血腫分辨率。然而，很難評價DFX在血液注入模型對ICH誘導的死亡率的影響，因為ICH模型在老年鼠和年輕鼠的死亡率都很低。人的平均壽命是70年，一個雄性大鼠的平均壽命是2年或3年。12個月大鼠相當于人類的50歲。大腦內注射自體血后引起腦組織氧化損傷和神經細胞凋亡[10]。鐵誘導的腦損傷可能由于激活氧化應激，也可能是由于游離鐵促進氧自由基形成，氧化應激下損傷DNA。

DFX是鐵螯合劑，其分子量為657 KD，全身給藥后DFX能夠迅速穿透血腦屏障，在腦組織中積累。本研究選擇DFX的注射劑量為100 mg/kg，因為有研究[5]表明，這個劑量可以有效減少年輕或老年大鼠ICH引起的腦損傷。本研究中，TUNEL陽性細胞數在ICH后1 d達到頂峰，而DFX能夠降低ICH后1 d時TUNEL陽性細胞數，表明DFX可以降低老年大鼠ICH模型神經元死亡。本研究使用感覺運動行為試驗評價ICH后神經功能缺損，結果顯示，DFX能夠改善老年大鼠前肢放置實驗和轉角實驗的分數。

ICH后產生一系列腦損傷保護機制。鐵蛋白，一種自然產生的鐵螯合劑，參與維持腦鐵代謝，且大腦能產生鐵蛋白。鐵蛋白有2個亞基：鐵蛋白重鏈，與鐵的利用率相關；鐵蛋白輕鏈，與鐵的存儲有關[11]。鐵蛋白合成主要是通過鐵或非鐵介導的轉錄后調節，而且腦內鐵蛋白水平上調可能參與神經保護[12]。腦內鐵蛋白水平在ICH后逐步增加。本研究發現，DFX處理顯著降低了老年大鼠ICH后7 d腦鐵蛋白水平，表明DFX可以降低老年大鼠ICH模型的鐵超載，從而降低對鐵蛋白的誘導。此外，DFX對ICH后1 d的神經元凋亡有明顯效果，之前鐵蛋白大幅度上調，提示DFX可以螯合從血腫釋放出的鐵。

臨床研究中，高血漿鐵蛋白水平與ICH患者預后不良相關[9]。此外，血漿鐵蛋白水平與ICH患者血腫周圍水腫體積也存在正相關[13]。本研究中，ICH后3、7 d血漿鐵蛋白水平降低，但與對照組比較，差異無統計學意義，需要進一步研究來確定上調血漿鐵蛋白水平在ICH后的作用機制。

總之，DFX全身注射后能夠減少ICH引起的老年大鼠神經元凋亡和神經功能缺失，提示DFX可以降低ICH誘導的腦損傷，其機制主要是通過抑制ICH的內源性反應，抑制鐵蛋白上調和減少血腫清除率。

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(學術編輯：吳碧華)

Effect of deferoxamine on the reduction of neuronal apoptosis in the aged Rats with acute intracerebral hemorrhage and its mechanism

CHANG Yuan1,WANG Min-juan2

(1.ClinicalMedicineCollege，Xi′anMedicalUniversity，Xi′an710021;2.DepartmentofGeratology，TheFirstAffiliatedHospitalofXi′anMedicalUniversity，Xi′an710077，Shaanxi，China)

Objective：To explore the effect of deferoxamine (DFX) on the reduction of neuronal apoptosis in the aged rats with acute intracerebral hemorrhage (ICH) and its mechanism.Methods：Autologous blood 100 μL was injected into the caudate putamen in the right basal ganglia region of male SD rats.After that,the rats were randomly assigned into observation group and control group.In observation group,DFX was injected 2 h after ICH,then once every 12 h until 7 d.The same amount of normal saline (NS) was injected into the rats in control group.The behavioristics were detected in both groups 1,3 and 7 d after ICH,and the hematoma size,neuronal apoptosis and levels of ferritin and plasma ferritin were also detected.Results：In observation group,the forelimb placement recovered obviously 7 d after ICH (P<0.01),the percentage of dextroversion decreased dramatically 3,7 d after ICH (P<0.01),and the hematoma resolution reduced significantly 7 d after ICH (P<0.01).The number of TUNEL positive cells in observation group decreased markedly 1 d after ICH (P<0.05),but there was no statistical significance between two groups by comparison to the number of TUNEL positive cells 3 d after ICH (P>0.05).The expression of ferritin heavy chain and ferritin light chain in observation group went down significantly (P<0.05);3 and 7 d after ICH,the level of plasma ferritin decreased slightly,but the difference wasn′t statistically significant by comparison to the control group(P>0.05).Conclusion：DFX can alleviate neuronal apoptosis and neurologic impairment of aged rats with acute ICH,which exerts a protective effect possibly by impacting the endogenic reaction of acute ICH.

Acute intracerebral hemorrhage;Deferoxamine;Apoptosis;Aged rats

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.03.011

陜西省教育廳專項科研計劃項目(2010JK808)；西安醫學院科研基金青年項目(2007QN02)；西安醫學院附屬醫院科研基金項目(XYFY08-08)

2016-01-26

常遠(1987-)，女，碩士，助教。通訊作者：王敏娟，E-mail：yl_wmj@163.com

時間：2016-6-1617∶46

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160616.1746.022.html

1005-3697(2016)03-0324-04

R743.3

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