miR-223基因家族的分子進化與靶基因預測

鐘曉武，青玉鳳，楊其彬，何泳龍，趙明才，謝文光，周京國

(川北醫學院附屬醫院 1.檢驗科；2.風濕免疫科；3.醫學研究中心，四川 南充　637000)

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miR-223基因家族的分子進化與靶基因預測

鐘曉武1，3，青玉鳳2，楊其彬2，何泳龍2，趙明才1，3，謝文光1，周京國2

(川北醫學院附屬醫院 1.檢驗科；2.風濕免疫科；3.醫學研究中心，四川 南充637000)

目的：分析所有miR-223基因家族成員的序列特征，并對miR-223靶基因進行預測，然后分析miR-223靶基因的生物學功能。方法：利用Clustal X 1.83軟件分析miR-223基因序列特征，MEGA 5.0軟件分析進化關系，再運用TargetScan、PicTar和miRDB進行靶基因預測，最后GO和KEGG進行功能分析。結果：在miRBase數據中獲得 miRNA-223基因家族成員的序列27條，絕大部分位于基因間隔區，少數成員的基因位置未知。大部分定位于X染色體，部分成員位于常染色體。miRNA-223成熟序列長度在20-23nt之間，同源性較高。系統進化樹分析表明，miRNA-223基因家族成員分為三支。預測獲得人類miRNA-223的可能具有27個靶基因，它們主要與信號轉導、轉錄調控以及細胞生長發育等密切相關。結論：本研究結果不僅有利于理解miR-223基因家族的生物學功能，也可為后續研究提供理論依據。

miRNA-223；分子進化；靶基因；功能分析

miRNAs是一類大小約20～25個核苷酸的內源性非編碼小分子，廣泛存在于病毒，植物，人類等真核生物[1]。早在1993年，Lee等[2]從線蟲中發現了第一個小RNA—lin-4。之后，Reinhart等[3]發現了第二個小RNA—let-7，它們參與線蟲發育的時序調控。2001年，三個不同的研究小組同時鑒定了多個小 RNA，并且正式命名為miRNA，從而掀起miRNA研究的熱潮[4-6]。研究表明miRNA主要是參與基因轉錄后的調控，通過與靶基因特異性結合，抑制靶基因的翻譯甚至降解[7]。經過十幾年的miRNA作用機理的深入研究，人們發現miRNA在疾病的發生發展過程具有重要作用，miRNA的表達失調與多種人類疾病相關，揭示miRNA可能成為疾病早期診斷和預測的生物標記，同時也是藥物開發的新靶點，可能為人類疾病的治療提供新型治療方法[8]。

miR-223定位于X染色體，已有的研究表明與腫瘤、炎癥相關的信號轉導通路具有密切的聯系。Chen等[9]研究發現miR-223骨髓中優勢表達，Mi等[10]發現miR-223在急性髓細胞性白血病(Acute myeloid leukemia,AML)患者中顯著性高表達，進一步研究表明了miR-223在調節AML起著重要作用。miR-223在慢性淋巴細胞白血病(Chronic myelognous leukemia,CLL)患者中則表達下調，這些異常表達可能與腫瘤負荷及腫瘤侵襲性相關[11]。miR-223在肝癌中癌旁組織中表達量高于癌組織，而在卵巢癌中原發性低于復發性，暗示miRNA可能成為癌癥的生物標記[12-13]。已經研究證實：miR-223在骨髓損傷中表達量增高，并且與炎性因子呈現正相關[14]。在類風濕關節炎患者的滑膜細胞miR-223 過度表達，從而可以抑制破骨細胞的形成[15-16]。miR-223在骨關節炎患者表達量也升高[17]，不過在活動期的系統性紅斑狼瘡腎炎患者是顯著降低的[18]。說明miR-223 在觸發炎癥信號通路和在炎性、免疫性疾病的發生過程中有重要的調節作用。

目前對miR-223的具體作用機制認識還是有限的，然而研究miR-223生物學功能首先是要準確預測miR-223的靶基因和弄清楚miR-223及其靶基因的相互關系。本研究利用miRNA的進化保守性, 探討miR-223基因家族的進化特征。采用三個在線分析軟件TargetScan、PicTar和miRDB分析miR-223的靶基因，然后分析了靶基因的生物學功能，為揭示miR-223靶基因的作用機制及功能研究提供理論參考和數據支持。

1　材料與方法

1.1獲取數據

從 miRBase[19](http://www.mirbase.org/cgi-bin/browse.pl) 中下載所有物種miR-223基因家族成員的成熟序列。

1.2序列比對與系統進化關系

利用Clustal X 1.83軟件[20]對miR-223基因的成熟序列進行多序列比對，分析所有序列特征。再用MEGA 5.0軟件[21]構建系統進化樹，采用基于距離參數的鄰接法(Neighbor-joining, NJ)，并自舉檢驗1 000次。

1.3靶基因預測

采用在線軟件TargetScan[22](http://www.targetscan.org/)、PicTar[23](http://www.pictar.org/)和miRDB[24](http://mirdb.org/miRDB/)預測人類miR-223的靶基因，最后以三者預測結果的交集作為miR-223候選的靶基因。

1.4靶基因的功能分析

運用GO: Gene Ontology[25](http://geneontology.org/)和KEGG:Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes[26](http://www.kegg.jp/)兩個數據庫共同分析靶基因的生物學功能，進一步認識miR-223的生物學功能。

2　結果與分析

2.1miRNA-223基因家族成員的分布特征分析

通過同源性搜索在miRBase數據中獲得 miRNA-223基因家族成員的序列27條，主要分布于人類、猩猩、鼠、斑馬魚等27個物種中。miRNA-223基因家族成員在基因組中都只有一個拷貝，而且絕大部分位于基因間隔區，少數成員的基因位置未知。miRNA-223大部分定位于X染色體，部分成員位于常染色體，少數基因定位不明確(表1)。

表1　不同物種miRNA-223基因家族成員在基因組的分布特征

2.2miRNA-223基因家族序列的同源性

序列比對結果發現miRNA-223基因家族成員的序列長度是相近的，在20-23nt之間。保守堿基數為20個(除了鉗魚為8個)，說明同源性較高。miRNA的種子序列(5’端第2-8個核苷酸)在與靶基因3’UTR特異性結合后行使功能是非常重要，而且這段序列在通常是保守的，我們的比對結果證實了這一點。miRNA-223的部分位點在不同物種發生了核苷酸突變和缺失，導致miRNA-223基因家族成員間的成熟序列長度產生變化(圖1)。

2.3miRNA-223基因家族成員系統進化分析

對27個物種的miRNA-223基因家族成員進行進化分析，由圖2可見，系統進化樹分為三支：鉗魚單獨聚為一支，安樂蜥和眼鏡王蛇聚為一支，人類等24個物種聚為一支。說明了人類的miRNA-223與安樂蜥、眼鏡王蛇和鉗魚的分子系統進化關系較遠，與其他23個物種的進化關系較近。

2.4miRNA-223靶基因預測及功能分析

利用TargetScan、PicTar和miRDB預測人類miRNA-223的靶基因分別獲得562、180和242個基因(圖3)，最后取三者的交集作為候選靶基因共27個(表2)。通過GO和KEGG分析獲得人類miRNA-223的27個共同候選靶基因的功能注釋，發現這些候選靶基因主要與信號轉導、轉錄調控以及細胞生長發育等密切相關，表明人類miRNA-223廣泛參與了生命活動的重要調控過程。另外，雖然在三個預測軟件的共同靶基因中沒有NLRP3，但是在TargetScan與miRDB中預測到了NLRP3 (NM_001127461)，而且Bauernfeind等[27]已經通過實驗研究證實 NLRP3 (NLR family,pyrin domain containing 3) 是miR-223的靶基因，miR-223基因能夠負性調節NLRP3的表達，從而影響NLRP3炎性小體的活性。

表2　3個靶基因分析軟件均能預測到的miRNA-223靶基因

3　討論

miRNA是由機體自我產生，主要通過與靶基因3’-UTR配對結合來實現對基因的轉錄水平或者轉錄后水平方式調控，調節基因的表達。miRNA參與各種生物學過程，在正常生長發育至關重要。本研究涉及的miR-223基因家族廣泛存在于低等動物到高等動物，而且其成熟序列除了鉗魚外，其他所有物種的種子序列高度保守。Roberto等[28]研究發現miR-223的這種序列高度保守，暗示miR-223功能的保守性，說明miR-223基因在生物遷移和進化過程中具有重要作用。miRNA的進化機制是通過序列重復及變異進行進化，而且很可能與靶基因的進化方式相似。因此，通過鑒定及預測miRNA的靶基因，對研究miRNA的生物學功能有重要的指導作用。

本研究運用生物信息學方法,TargetScan、PicTar和miRDB三個在線分析軟件預測miR-223的共同靶基因, 通過GO和KEGG分析miR-223基因家族成員的生物學功能，進一步了解miR-223可能的作用機制及其在生物體內扮演的角色。由于miRNA序列比較短，能找到的靶點假陽性比較多，因此利用多種miRNA靶基因預測軟件主要是為了縮小一下實驗的范圍，能夠減少 miRNA 靶基因尋找的盲目性, 節約實驗成本。再者不同預測軟件的運用預測算法不同，這3個數據庫預測的結果之間存在著很大的差異，每個算法無法反映 miRNA-mRNA互作生物過程的全貌，但至少是某幾方面的反映。不同的運算方法可以預測出不同的 miRNA 結合位點, 因此同時使用多種預測軟件進行預測仍然十分必要。對于本文預測的靶基因正確與否，這就需要后期的生物學實驗進行驗證和完善。

本研究預測發現人類miR-223具有27個候選靶基因，它們主要參與了信號轉導、轉錄調控以及細胞生長發育等多種生物學過程。Jia等[29]研究發現過量表達的miR-223能夠靶向調控胰島素樣生長因子1受體的表達，影響下游PI3K/AKt和mTOR信號通路，進而抑制Hela細胞的增殖。miR-223抑制了下游靶基因F-box和WD重復包含域7(FBXW7)，影響了癌基因蛋白的泛素化降解，與癌癥的發生發展相關[30]。Rodríguez-Vicent等[31]研究發現miR-223在CLL病人中表達量降低，熱激蛋白90β-1(HSP90B1)表達量則增加，深入研究顯示miR-223對HSP90B1負調控。Moles等[32]發現 miR-223減少了信號轉導和轉錄激活子1(STAT1)的表達，阻斷了STAT1信號在人類T細胞中轉導。在巨噬細胞中miR-223通過靶定STAT3，激活 TLR 炎性通路并釋放炎癥因子 IL-6、IL-1β起到促炎的作用[33]。miR-223還可以抑制NLRP3炎性體的活性，研究證實NLRP3是miR-223作用靶基因，負性調節NLRP3的表達[27]，能夠影響炎癥反應。這些研究結果都證明了生物信息學預測結果的有效性。因此，對miR-223基因家族靶基因的預測不僅可以了解其可能參與的生物學過程，還能夠為后續實驗研究提供理論參考和數據支持。

[1]Svoboda P.A toolbox for miRNA analysis.FEBS Lett[J].2015,589(14):1694-1701.

[2]Lee RC,Feinbaum RL,Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J].Cell,1993,75(5):843-854.

[3]Reinhart BJ,Bartel DP.Small RNAs correspond to centromere heterochromatic repeats [J].Science,2002,297(5588):1831.

[4]Lagos-Quintana M,Rauhut R,Lendeckel W,etal.Identification of novel genes coding for small expressed RNAs [J].Science,2001,294(5543):853-858.

[5]Lau NC,Lim LP,Weinstein EG,etal.An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans [J].Science,2001,294(5543):858-862.

[6]Lee RC,Ambros V.An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans [J].Science,2001,294(5543):862-864.

[7]Wan X,Ding X,Chen S,etal.The functional sites of miRNAs and lncRNAs in gastric carcinogenesis [J].Tumour Biol,2015,36(2):521-532.

[8]Zhou B,Li Z,Yang H,etal.Extracellular miRNAs:origin,function and biomarkers in hepatic diseases [J].J Biomed Nanotechnol,2014,10(10):2865-2890.

[9]Chen CZ,Li L,Lodish HF,etal.MicroRNA modulate hematopoietic lineage differentiation [J].Science,2004,303(5654):83-86.

[10]Mi S,Lu J,Sun M,etal.MicroRNA expression signatures accurately discriminate acute lymphoblastic leukemia from acute myeloid leukemia[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007, 104(50):19971-19976.

[11]Stamatopoulos B,Meuleman N,Haibe-Kains B,etal.microRNA-29c and microRNA-223 down-regulation has in vivo significance in chronic lymphocytic leukemia and improves disease risk stratification[J].Blood,2009,113(21):5237-5245.

[12]Wong QW,Lung RW,Law PT,etal.MicroRNA-223 is commonly repressed in hepatocellular carcinoma and potentiates expression of Stathmin1[J].Gastroenterology,2008,135(1):257-269.

[13]Laios A,O'Toole S,Flavin R,etal.Potential role of miR-9 and miR-223 in recurrent ovarian cancer[J].Mol Cancer,2008, 7:35.doi:10.11 86/1476-4598-7-35.

[14]Johnnidis JB,Harris MH,Wheeler RT,etal.Regulation of progenitor cell proliferation and granulocyte function by microRNA-223[J]. Nature,2008,451(7182):1125-1129.

[15]Chen SY.MicroRNA-223:a double-edged sword in rheumatoid arthritis [J].Rheumatol Int,2014,34(2):285-286.

[16]Shibuya H,Nakasa T,Adachi N,etal.Overexpression of microRNA-223 in rheumatoid arthritis synovium controls osteoclast differentiation[J].Mod Rheumatol,2013,23(4):674-685.

[17]Okuhara A,Nakasa T,Shibuya H,etal.Changes in microRNA expression in peripheral mononuclear cells according to the progression of osteoarthritis[J].Mod Rheumatol,2012,22(3):446-457.

[18]Carlsen AL,Schetter AJ,Nielsen CT,etal.Circulating microRNA expression profiles associated with systemic lupus erythematosus[J].Arthritis Rheum,2013,65(5):1324-1334.

[19]Kozomara A,Griffiths-Jones S.miRBase:annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data[J].Nucleic Acids Res,2014,42(Database issue):D68-73.

[20]Thompson JD,Gibson TJ,Higgins,DG.Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX [M].Curr Protoc Bioinformatics,2002,Chapter 2:Unit 2.3.

[21]Tamura K,Peterson D,Peterson N,etal.MEGA5:Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood,Evolutionary Distance,and Maximum Parsimony Methods [J].Mol Biol Evol,2011,28(10):2731-2739.

[22]Garcia DM,Baek D,Shin C,etal.Weak seed-pairing stability and high target-site abundance decrease the proficiency of lsy-6 and other microRNAs [J].Nat Struct Mol Biol,2011,18(10):1139-1146.

[23]Krek A,Grün D,Poy MN,etal.Combinatorial microRNA target predictions [J].Nat Genet,2005,37(5):495-500.

[24]Wong N,Wang X.miRDB:an online resource for microRNA target prediction and functional annotations [J].Nucleic Acids Res,2015,43(Database issue):D146-52.

[25]Gaudet P,Chisholm R,Berardini T,etal.The Gene Ontology′s Reference Genome Project: a unified framework for functional annotation across species [J].PLoS Comput Biol,2009,5(7):e1000431.

[26]Kanehisa M,Goto S,Sato Y,etal.Data,information,knowledge and principle:back to metabolism in KEGG [J].Nucleic Acids Res,2014,42:D199-205.

[27]Bauernfeind F,Rieger A,Schildberg FA,etal.NLRP3 inflammasome activity is negatively controlled by miR-223[J].J Immunol,2012,189(8):4175-4181.

[28]Roberto VP,Tiago DM,Gautvik K,etal.Evidence for the conservation of miR-223 in zebrafish (Danio rerio):Implications for function[J].Gene,2015,566(1):54-62.

[29]Jia CY,Li HH,Zhu XC,etal.MiR-223 suppresses cell proliferation by targeting IGF-1R[J].PLoS One,2011,6(11):e27008.

[30]Kurashige J,Watanabe M,Iwatsuki M,etal.Overexpression of micro RNA-223 regulates the ubiquitin ligase FBXW7 in oesophageal squamous cell carcinoma.Br J Cancer,2012,106(1):182-188.

[31]Rodríguez-Vicente AE,Quwaider D,Benito R,etal.MicroRNA-223 is a novel negative regulator of HSP90B1 in CLL[J].BMC Cancer,2015,15(1):238.

[32]Moles R,Bellon M,Nicot C.STAT1:A novel target of miR-150 and miR-223 is involved in the proliferation of HTLV-I-transformed and ATL cells[J].Neoplasia,2015,17(5):449-462.

[33]Chen Q,Wang H,Liu Y,etal.Inducible microRNA-223 down-regulation promotes TLR-triggered IL-6 and IL-1beta production in macrophages by targeting STAT3[J].PLoS One,2012,7(8):e42971.

(學術編輯：劉劍平)

Molecular evolution of miR-223 gene family and prediction of their target genes

ZHONG Xiao-wu1，3,QING Yu-feng2,YANG Qi-bin2,HE Yong-long2,ZHAO Ming-cai1，3,XIE Wen-guang1,ZHOU Jing-guo2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofRheumatologyandImmunology;3.MedicineResearchCenter,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China)

Objective：This study aims to investigate the function of miR-223 gene family members,predict the miR-223 target gene and analyze the biological function of the miR-223 target gene.Methods：The sequence characteristic and molecular evolution of miR-223 were analyzed by Clustal X 1.83 and MEGA 5.0. TargetScan,PicTar and miRDB were used to predict target genes and the GO and KEGG were used to analyze the function annotation.Results：27 members of miR-223 gene family were obtained from miRBase database.Most of them were located in the intergenic region and a few in unknown region.A majority of miR-223 existed in X chromosome and a few in autosome.miR-223 mature sequences were from 20 to 23 nt in length and possessed high homology.Phylogenetic analysis indicated three sublines of miR-223 gene family members.27 target genes of miR-223 were predicted.And they were related with the process of signal transduction,regulation of transcription,cell growth and development and so on.Conclusion：Those results are not only of potential importance for further study on the function of miR-223 gene family members,but aslo for providing theory basis of subsequent experiment research.

miRNA-223;Molecular Evolution;Target Genes;Functional analysis

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.03.09

國家自然科學基金(81272047)；四川省教育廳科研項目(15ZB0197)；南充市科技支撐項目(14A0061)；川北醫學院科研發展計劃博士科研啟動基金(CBY14-QD-07，CBY13-QD-03)

2015-07-28

鐘曉武(1983-)，男，講師。zxw_strive@163.com。通訊作者：周京國， jgzhou@nsmc.edu.cn。

時間：2016-6-1617∶46

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160616.1746.018.html

1005-3697(2016)03-0315-06

Q75；S814.8

A