嬰兒利什曼原蟲細胞免疫優勢抗原預測

敬昊東，敬保遷

(川北醫學院免疫學與分子生物學研究所，四川 南充　637000)

?

嬰兒利什曼原蟲細胞免疫優勢抗原預測

敬昊東，敬保遷

(川北醫學院免疫學與分子生物學研究所，四川 南充637000)

目的：預測嬰兒利什曼原蟲全基因組編碼蛋白中刺激細胞免疫應答的優勢抗原。方法：以計算機軟件NetCTLpan對嬰兒利什曼原蟲基因組編碼蛋白進行分析，確定與各類人HLA I類分子超型強結合抗原蛋白，綜合預測細胞免疫優勢抗原。結果：84個嬰兒利什曼原蟲基因組編碼蛋白可與人HLA A2超型強結合，其中13個蛋白質還可與人HLA A1、A3、A26、B44、B7、B8、B58、B62、B39及B27超型強結合，它們大多數為膜蛋白，具有種屬特異性。結論：預測嬰兒利什曼原蟲優勢抗原可為發展抗內臟利什曼病疫苗提供新的視角。

嬰兒利什曼原蟲；免疫優勢抗原；疫苗；免疫組學

內臟利什曼病主要由嬰兒利什曼原蟲與杜氏利什曼原蟲引起，目前全世界每年新發病例約50萬，我國新疆、甘肅、四川地區內臟利什曼病流行嚴重[1-2]。由于利什曼原蟲感染宿主呈多樣性，傳播媒介具有復雜性，抗利什曼病藥物品種少、療效差、毒副作用嚴重，發展疫苗是控制利什曼病的根本方法[3]。先前許多有關內臟利什曼病候選疫苗抗原的研究均是選擇單個抗原分子對實驗動物免疫保護試驗來進行，所獲得的候選疫苗分子對人的免疫保護較弱，至今仍未研制出應用于現場的抗內臟利什曼病疫苗[4]。鑒于嬰兒利什曼原蟲全基因組DNA序列測定及基因注釋已完成，總共含8 241個基因[5]。隨著免疫信息學的發展，有關MHC分子結合肽相關實驗數據積累增多，使用生物信息學方法可較準確地預測MHC分子結合表位，

從而判斷病原體刺激機體細胞免疫和體液免疫應答的相關抗原蛋白。本研究立足人體免疫系統，采用計算機軟件NetCTLpan，從嬰兒利什曼原蟲全基因組編碼蛋白質中預測刺激細胞免疫應答優勢抗原，其目的是為發現抗人內臟利什曼病候選疫苗分子提供新的視角。

1　數據庫和方法

1.1數據庫

為2015年6月更新的嬰兒利什曼原蟲JPCM5株基因組注釋蛋白序列庫(TriTrypDB-9.0_LinfantumJPCM5_AnnotatedProteins.fasta )，共計8 241個蛋白。

1.2計算機軟件

采用丹麥技術大學MHC結合肽預測服務器中NetCTL 1.2版軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)[6]與NetCTLpan 1.1版軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTLpan/)[7]。蛋白質亞細胞定位軟件為WoLF PSORT(http://www.genscript.com/wolf-psort.html)[8]。蛋白質相似性檢索采用軟件BLASTP(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

1.3方法

1.3.1基于HLAA2超型篩選嬰兒利什曼原蟲細胞免疫優勢抗原 從Gene DB庫中下載嬰兒利什曼原蟲JPCM株9.0版本基因組注釋蛋白序列庫，分批將各注釋蛋白上傳至丹麥技術大學MHC結合肽預測服務器NetCTL 1.2(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)進行運算。MHC超型設定為A2，將C末端切割權重設定為默認值0.15，TAP轉運效率權重設定為默認值0.05，表位識別閾值設定為默認值0.75。若目標蛋白肽鏈長度≥400 aa，A2超型強結合表位的頻度大于或等于2/100aa者，則認定為A2超型強結合抗原蛋白。若目標蛋白肽鏈長度<40 0 aa，A2超型強結合表位的頻度大于或等于3/100 aa者，則認定為A2超型強結合抗原蛋白。

1.3.2基于其它HLAI類分子超型篩選嬰兒利什曼原蟲細胞免疫優勢抗原 將上述篩選的與HLA A2超型強結合嬰兒利什曼原蟲蛋白，逐個上傳至丹麥技術大學MHC結合肽預測NetCTLpan 1.1服務器(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTLpan/)進行運算。HLA超型分別設定為A1、A3、A26、B44、B7、B8、B58、B39、B27及B62，肽長度設定為9 mer，C末端切割權重設定為默認值0.225，TAP轉運效率權重設定為默認值0.025，表位識別閾值設定為默認值1.0。若各目標蛋白含有上述所有HLA超型強結合表位，則認定為細胞免疫優勢抗原。

1.3.3嬰兒利什曼原蟲細胞免疫優勢抗原的特異性與表達定位登錄蛋白質相似性檢索軟件BLASTP服務器(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)與蛋白質亞細胞定位軟件WoLF PSORT服務器(http://www.genscript.com/wolf-psort.html)，分別將上述篩選的各嬰兒利什曼原蟲細胞免疫優勢抗原蛋白的氨基酸序列發送至服務器，分別推測上述各嬰兒利什曼原蟲細胞免疫優勢抗原的種屬特異性和亞細胞定位。

2　結果

2.1嬰兒利什曼原蟲基因組編碼蛋白中與HLA A2超型強結合抗原

嬰兒利什曼原蟲JPCM株基因組編碼的8，241個蛋白質經NetCTL 1.2計算機軟件分別分析各蛋白質所含HLA A2超型強結合表位數，發現有166個編碼蛋白質含有A2超型強結合表位的頻度大于2個/100 aa，剔除重復基因及序列高度相似的家族基因等，84個編碼蛋白被認定為A2超型強結合的抗原蛋白質(表1)。其中，蛋白肽鏈氨基酸小于400 aa的A2超型強結合蛋白質有24個，蛋白肽鏈氨基酸大于或等于400aa的A2超型強結合蛋白質有56個。在肽鏈長度小于400 aa的A2超型強結合蛋白質中，以無鞭毛體素樣蛋白(LinJ.08.0700|amastin-like protein)含A2超型強結合表位的頻度最高，平均每100 aa長的肽鏈中含有7個超型A2強結合表位；另外，脂肪酸延長酶(LinJ.14.0760|fatty acid elongase)假定蛋白(LinJ.29.0970| hypothetical protein, conserved)、假定蛋白(LinJ.23.1830| hypothetical protein)、假定蛋白(LinJ.36.3110| hypothetical protein)、假定蛋白(LinJ.36.3110| hypothetical protein)、假定蛋白(LinJ.16.0510| hypothetical protein)等，平均100aa的肽鏈中含5～6個A2超型強結合表位。在肽鏈長度大于或等于400 aa的A2超型強結合蛋白質中，以(LinJ.35.5320| amino acid permease)含A2超型強結合表位的頻度最高，平均每100 aa長的肽鏈中含有5.61個A2超型強結合表位，另乙醇胺磷酸轉移酶(LinJ.18.0810|ethanolamine phosphotransferase)、甘油攝取蛋白(LinJ.35.2120| glycerol uptake protein)、假定蛋白(LinJ.33.1650| hypothetical protein)及假定蛋白(LinJ.29.0970| hypothetical protein)等，平均100 aa的肽鏈中含4～5個A2超型強結合表位，并且隨著蛋白質分子量的增大，所含A2超型強結合表位的比例呈下降趨勢。

2.2嬰兒利什曼原蟲基因組編碼蛋白中與其它HLA I類分子超型結合的抗原

以NETMHCPAN計算機軟件分別計算上述84個A2超型強結合嬰兒利什曼原蟲蛋白質序列含HLA A1、A3、A26、B44、B7、B8、B58、B39、B27及B62等10個超型的強結合表位，結果發現其中有13個蛋白質含有全部上述10個HLA I類分子超型強結合表位(表2)，認定為嬰兒利什曼原蟲細胞免疫優勢抗原蛋白。其中ATP結合盒蛋白超家族分子成員2(LinJ.11.1210 | ATP-binding cassette protein subfamily A,member 2)、保守性假定蛋白(LinJ.34.3020 | hypothetical protein)及保守性假定蛋白(LinJ.31.0040 | hypothetical protein)，它們不僅含A2超型強結合表位的頻度較高，平均100 aa的肽鏈所含A2超型強結合表位達4個，而且還含有全部其它10個HLA I類分子超型強結合表位，提示這些蛋白質用作抗利什曼病疫苗候選疫苗分子，不僅對最常見HLA I類分子超型—A2超型人群具有較好的細胞免疫刺激效應，而且對其它HLA I類分子超型人群亦有效。上述嬰兒利什曼原蟲細胞免疫優勢抗原蛋白的肽鏈長度介于437～1 897 aa，而肽鏈長度小于400 aa的嬰兒利什曼原蟲A2超型強結合抗原蛋白其序列則缺乏某些HLA I類分子超型強結合表位，說明中小分子嬰兒利什曼原蟲A2超型強結合抗原蛋白不能激發某些HLA I類分子超型人群產生強的細胞免疫保護。

表1　嬰兒利什曼原蟲基因組編碼蛋白中與HLA A2超型強結合抗原

表2　與HLA I類分子常見超型強結合的嬰兒利什曼原蟲基因組編碼蛋白的強結合表位數

2.3嬰兒利什曼原蟲細胞免疫優勢抗原蛋白的細胞定位與特異性

上述13個嬰兒利什曼原蟲細胞免疫優勢抗原蛋白質經BLASTP檢索及WoLF PSORT計算機軟件分析，結果這些蛋白質均具有種屬特異性，亞細胞定位于細胞膜。

3　討論

利什曼原蟲為細胞內感染病原體，病人痊愈后，可獲得對相同種株再次感染的持續性免疫保護，保護免疫性質主要為細胞免疫[9]。說明利什曼原蟲含有可刺激人產生保護性細胞免疫的抗原分子，成功研制出抗利什曼病疫苗可能性較大。

本研究采用計算生物學方法同時分析嬰兒利什曼原蟲整個基因組編碼的8 241個蛋白質抗原對HLA I類分子間的結合性能，篩選嬰兒利什曼原蟲編碼蛋白中可刺激人體細胞免疫的優勢抗原。克服了先前許多學者隨機選擇單個抗原進行抗利什曼病候選疫苗分子研究的盲目性[10]，也克服了其它規模性篩選技術如四聚體技術與TCR識別技術等不能識別隱蔽性表位的缺陷，也克服了免疫蛋白質組學等不能直接反應細胞免疫狀況的局限性，使結果更加全面、貼切地反映嬰兒利什曼原蟲全基因組編碼蛋白激發人細胞免疫狀況。本研究以HLA I類分子來研究靶抗原激發細胞免疫特征，所獲結果直接反映靶抗原激發人體細胞免疫應答狀況，克服了以實驗動物膜型反映人利什曼病感染免疫的差異性[11]。并且，本研究中不僅觀測了嬰兒利什曼原蟲全基因組編碼蛋白與人類最常見A2超型間的相互作用，而且也觀測了嬰兒利什曼原蟲全基因組編碼蛋白與其它HLA I類分子超型間的相互作用，綜合篩選出的嬰兒利什曼原蟲細胞免疫優勢抗原蛋白可激發絕大多數人群細胞免疫保護。

計算生物學研究獲得可靠結果關鍵在于所采用的計算機軟件及參數設置。先前Stober等觀察101個隨機選擇的碩大利什曼原蟲cDNA序列標簽做成的DNA候選疫苗對Balb/c小鼠的免疫保護性，發現14個候選疫苗具有免疫保護性能，其中功能明確的僅有P型ATP酶(P-type ATPase)和無鞭毛體素樣蛋白(amastin-like protein)等分子，其余10個均為假定蛋白編碼基因，以MHC結合表位預測軟件RANKPEP(http://mif.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html)計算，上述14個具有免疫保護性能的抗原蛋白與其它無免疫保護性的碩大利什曼原蟲抗原蛋白所含MHC結合表位數無明顯差異，說明RANKPEP預測的準確性較差。而本研究所采用的預測軟件NetCTL 1.2與NetMHCPAN，整合了蛋白酶體切割，TAP轉運效率及MHC I類分子結合表位預測，優于其它如EpiJen，MAPPP， MHC-pathway和WAPP等CTL表位預測軟件[6]，本研究預測結果發現P-type ATPase和amastin-like protein及部分假定蛋白等存在大量HLA I類分子強結合表位，與Stober等的動物實驗結果存在一致性。說明本研究采用的軟件及所設參數較為準確[12]。

本研究篩選出的絕大多數嬰兒利什曼原蟲細胞免疫優勢抗原蛋白在既往利什曼病感染免疫研究中均未曾認識，它們分子量較大，具有種屬特異性，大多為膜型蛋白，說明免疫原性較好。深入認識這些抗原蛋白，對發展抗利什曼病疫苗極為有利[13]。

[1]余大為，丁國武，格鵬飛，等．2005-2014年甘肅省內臟利什曼病流行情況的回顧性分析[J] ．中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2015，33(3)：208-211．

[2]伊斯拉音·烏斯曼，阿迪力·司馬義，凱賽爾·克尤木，等．2014 年新疆伽師縣內臟利什曼病暴發的調查分析[J]．中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2015，33(5)：357-361．

[3]Chappuis F，Sundar S，Hailu A，etal．Visceral leishmaniasis：what are the needs for diagnosis，treatment and control[J]． Nat Rev Microbial，2007，5(11):873-882．

[4]Joshi S，Rawat N，Yadav NK，etal．Visceral leishmaniasis：advancements in vaccine development via classical and molecular approaches[J]．Front Immunol，2014，5：380．doi:10.3389/f

[5]Peacock CS,Seeger K,Harris D,etal．Comparative genomic analysis of three Leishmania species that cause diverse human disease[J]．Nat Genet，2007，39(7)：839-847．

[6]Larsen MV，Lundegaard C，Lamberth K，etal．Large-scale validation of methods for cytotoxic T-lymphocyte epitope prediction[J]．BMC Bioinformatics，2007，8：424．

[7]Stranzl T，Larsen MV，Lundegaard C，etal．NetCTLpan-Pan-specific MHC class I epitope predictions[J]．Immunogenetics，2010，62(6)：357-368．

[8]Horton P，Park KJ，Obayashi T，etal．WoLF PSORT：protein localization predictor[J]．Nucleic Acids Res. 2007，35：W585-7．

[9]劉鵬，敬保遷．利什曼原蟲減毒活疫苗研究進展[J]．川北醫學院學報，2015，30(5)：590-594．

[10]Duthie MS，Raman VS，Piazza FM，etal．The development and clinical evaluation of second-generation leishmaniasis vaccines[J]．Vaccine，2012，30(2):134-141．

[11]Kamhwi S，oliveiar F，Valenzuela JG．Using humans to make a human leishmaniasis vaccine[J]．Sci Transl Med，2014，6(234)：234fs8.

[12]Stober CB，Lange UG，Roberts MT，etal．From genome to vaccines for leishmaniasis:screening 100 novel vaccine candidates against murine Leishmania major infection[J]．Vaccine，2006，24(14)：2602-2616．

[13]Das S，Freier A，Boussoffara T，etal．Moduler multiantigen T cell epitope-enriched DNA vaccine against human leishmaniasis[J]．Sci Transl Med，2014，6(234):234ra56．

(學術編輯：謝勇恩)

Prediction of Leishmania infantum immunodominant antigens

JING Hao-dong,JING Bao-qian

(InstituteofImmunologyandMolecularBiology,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China)

Objective：To predict the dominant antigen to stimulate human cellular immune responses in whole genome encoding proteins of Leishmania infantum.Methods：The whole genome encoding proteins of Leishmania infantum were analyzed with NetCTLpan computer software,and all kinds of HLA I molecules supertype strong binding protein antigen could be finalized,and the dominant antigens that stimulate human cellular immune responses be the comprehensively predicted.Results：84 Leishmania infantum genome encoding proteins could bind to human HLA A2 supertype compactly.Among these proteins,13 proteins could bind to human HLA A1,A3,A26,B44,B7,B8,B58,B62,B39 and B27 supertype,most proteins are species-specific proteins, and located in membrane.Conclusion：The dominant antigen prediction of Leishmania infantum provides a new insight to develop the vaccines against visceral leishmaniasis.

Leishmania infantum；Dominant antigen；Vaccine；Immunomics

10.3969/j.issn.1005-3697.2016.03.08

國家自然科學基金(30872234)

2016-04-01

敬昊東(1993-)，男，川北醫學院臨床醫學系2013級。通訊作者：敬保遷，E-mail：bqjing@nsmc.edu.cn

時間：2016-6-1617∶46

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160616.1746.016.html

1005-3697(2016)03-0310-06

R382.22

A