流式細胞術用于鮑曼不動桿菌體外藥敏試驗的研究

趙旭鴻，沈菊英，蔡惠萍，陳魯藝，李　智，徐　龍

(同濟大學附屬楊浦醫院檢驗科，上海 200090)

?

·論著·

流式細胞術用于鮑曼不動桿菌體外藥敏試驗的研究

趙旭鴻，沈菊英，蔡惠萍，陳魯藝，李智，徐龍△

(同濟大學附屬楊浦醫院檢驗科，上海 200090)

目的探討流式細胞術(FCM)方法快速檢測鮑曼不動桿菌體外藥敏試驗的臨床應用價值。方法選用碘化丙啶(PI)作為熒光染料，用FCM檢測大腸埃希菌標準菌株和66株鮑曼不動桿菌臨床菌株對舒氨西林、左氧氟沙星、美羅培南、頭孢噻肟鈉的敏感性。根據細菌培養物在不同濃度藥物作用后所檢測到的熒光強度來判斷細菌存活率，從而推斷MIC值。并與微量稀釋法和VITEK儀檢測結果進行比較。結果66株鮑曼不動桿菌流式細胞熒光法抗菌藥物敏感試驗(FCST)結果測得舒氨西林耐藥35株，左氧氟沙星耐藥30株，美羅培南耐藥13株，頭孢噻肟鈉耐藥38株。采用χ2檢驗，分別比較與微量稀釋法、VITEK儀檢測判斷的敏感性結果，差異均無統計學意義(P>0.05)。結論鮑曼不動桿菌流式細胞熒光法藥敏試驗與常規方法檢測結果具有一致性，并且更快速、靈敏、客觀。

流式細胞熒光法抗生素敏感試驗；鮑曼不動桿菌；舒氨西林；左氧氟沙星；美羅培南；頭孢噻肟鈉

通過抗菌藥物體外藥敏試驗檢測最低抑菌濃度(MIC)是臨床判斷細菌對抗菌藥物敏感性、合理使用抗菌藥物的重要依據。目前臨床上MIC的檢測方法包括微量稀釋法、紙片擴散法、試管肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法和Q試驗等。這些方法通常能提供細菌群體對抗菌藥物敏感性的均值，但不能發現細菌個體間藥敏反應的異質性，且操作煩瑣、耗時較長。鮑曼不動桿菌是引起醫院內感染的重要病原菌之一，其耐藥性日益嚴重，尤其多重耐藥鮑曼不動桿菌，在臨床上選用抗菌藥物十分棘手。現有抗菌藥物藥敏試驗難以對多重耐藥鮑曼不動桿菌提供有價值的藥敏結果，不利于及時、有效地指導抗菌藥物使用[1-2]。自1982年有學者探索用FCM對大腸埃希菌進行抗菌藥物藥敏試驗，流式細胞熒光法抗菌藥物敏感試驗(FCST) 逐漸得到研究和發展[3]。FCST可以檢測到細菌群體中具有藥敏異質性的菌細胞，可為細菌藥敏試驗提供一種更為簡便快速、靈敏可靠的診斷方法[4]。本研究應用FCST檢測鮑曼不動桿菌MIC，并與常規藥敏試驗結果進行比較，探討其臨床應用價值。

1　資料與方法

1.1菌株大腸埃希菌標準菌株ATCC 25922由北京中國藥品生物制品檢定所提供；鮑曼不動桿菌臨床分離株收集至2013年4月至2014年9月本院細菌室，均經過VITEK全自動微生物鑒定儀鑒定。

1.2儀器與試劑流式細胞儀為美國Beckman-coulter公司EPICS-XL型；全自動微生物鑒定和藥敏系統為法國生物梅里埃公司VITEK32型。舒氨西林、左氧氟沙星、美羅培南、頭孢噻肟鈉標準品來自北京中國藥品生物制品檢定所；碘化丙啶(PI)為美國Sigma公司產品。

1.3方法

1.3.1FCST檢測挑取血瓊脂平板上單個待檢菌落，接種于MH液體培養基并用VITEK儀加以鑒定。將接種于MH液體培養基的待檢菌置于37 ℃水浴2 h孵育后，調整菌液濃度至0.5號麥氏濁度(相當于1.5×108cfu/mL)。在各FCST測定管中按抗菌藥物濃度梯度分別加入相應抗菌藥物和待檢菌液，制成終濃度為7.5×106cfu/mL、每管總體積為1 mL的細菌懸液，輕輕混勻，置37 ℃水浴孵育3 h后加入PI 10 μL/每管，搖勻并室溫避光15 min后上流式細胞儀進行檢測。FCST檢測每管至少獲取104個菌細胞。設置FCST數據收集分析方案，通過檢測散射光信號(SC)和碘化丙啶熒光信號(PI)對樣本進行分析。散射光信號包括前向散射光(FS)和側向散射光(SS)，FS強度與細胞大小呈正相關，SS強度與細胞顆粒度呈正相關。分別設置FS-SS雙參數圖和前向散射光/碘化丙啶熒光(FS/PI)雙參數圖。在FS-SS雙參數圖中調整電壓使擬進行分析的細菌群密集出現，并設門圈定菌細菌群，使其熒光信號出現在FS/PI雙參數圖中。FS/PI雙參數圖中PI表示PI的熒光信號強度(在X軸上以對數值表示)，分別以活菌和死菌作為陰性對照和陽性對照在圖上設定十字門，可提供陽性區域內PI陽性的細胞百分率(PI%)和X軸平均熒光強度(MFIx)等多種參數。檢測不同抗菌藥物濃度作用下菌株的PI%每株菌，同時以無藥活菌為陰性對照、以加熱死菌為陽性對照，其中敏感菌株的PI%隨著藥物濃度增加顯著增高，而耐藥菌株的PI%并不隨藥物濃度增高而有明顯變化，從而可推斷菌株的藥物敏感性和MIC。本文共檢測了66株鮑曼不動桿菌分離株及1株大腸埃希菌標準菌株。

1.3.2微量稀釋法參照衛生部《全國臨床檢驗操作規程》進行[5]。正式試驗前選擇部分菌株與試管稀釋法進行比較，敏感性結果相符。

1.3.3VITEK儀器檢測使用GNS-448檢測卡，微孔板中舒氨西林、左氧氟沙星、美羅培南、頭孢噻肟鈉的濃度分別為:8、32、64 μg/mL，1、4、8 μg/mL，2、4、8 μg/mL，6、24 μg/mL，菌液濃度為1.5×107cfu/mL。次日儀器報告結果。

1.4統計學處理應用SPSS18.0統計軟件對試驗數據作χ2檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2　結　　果

2.1無菌空白MH液體培養基FCM檢測結果僅在FS-SS圖左下角顯示少量肉湯顆粒，見圖1。

圖1　　無菌MH培養液

2.2不同生活狀態細菌FCM檢測結果取不加抗菌藥物正常生長的細菌作為陰性對照，用加熱處死的細菌作為陽性對照，用PI染色，上機檢測。活菌懸液(不含藥物)的結果顯示，一群集中較小的菌細胞處于熒光陰性的區域，死菌懸液的結果顯示，一群大小一致的細菌(92.15%)處于熒光強度很高的區域，表示大多數細菌已死亡，見圖2。

注：A表示活菌懸液；B表示死菌懸液。

圖2活菌懸液和死菌懸液FS-PI雙參數熒光圖

2.3不同濃度抗菌藥物作用細菌FCM檢測結果當抗菌藥物敏感菌株在各藥物濃度作用后，隨藥物濃度成倍增加，FS-SS圖中PI陰性區域內細胞漸少，PI熒光陽性區細胞漸多,如圖3。而抗菌藥物耐藥菌株在各個藥物濃度作用后，隨藥物濃度增加，FS-SS圖中PI陰性區域內細胞減少并不明顯，如圖4。

圖3　　敏感菌株經抗菌藥物作用后PI%

圖4　　耐藥菌株經抗菌藥物作用后PI%

2.4FCM藥敏試驗MIC判斷值的設定分別檢測大腸埃希菌標準菌株不加抗菌藥物陰性對照活菌和已知MIC濃度抗菌藥物作用細菌的PI%，據此結果，將PI%逐漸增高達到80%以上時的藥物濃度判為MIC值，表明該菌株對藥物敏感。若被測菌株PI%值不隨藥物濃度增加而明顯上升，說明其MIC值大于試驗藥物的最高濃度，則可判為菌株耐藥[6-7]。

2.5常規藥敏試驗與FCST結果比較本文用常規方法和FCST雙盲法對臨床分離的66株鮑曼不動桿菌分別檢測MIC，用χ2檢驗比較FCST與微量稀釋法、VITEK儀檢測判斷的敏感性結果，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1　　FCST與常規方法檢測耐藥性的情況(n=66,n)

注：與微量稀釋法比較，*P>0.05；與VITEK儀檢測比較，#P>0.05。

3　討　　論

鮑曼不動桿菌原本是一種自然界廣泛存在的條件致病菌，但隨著近年來廣譜抗菌藥物的廣泛使用和抗菌藥物選擇性壓力的不斷增加，它逐漸成為了機會感染和醫院感染的主要菌種之一。多中心研究已表明，鮑曼不動桿菌是目前引起醫院感染的重要病原菌之一[8]。許多醫院出現鮑曼不動桿菌分離率逐年上升，尤其多重耐藥的鮑曼不動桿菌，已成為醫院內感染暴發流行的重要病原菌，是重癥監護病房及老年患者呼吸道感染的主要致病菌之一[9-10]。

抗菌藥物體外藥敏試驗是指導臨床合理進行抗感染治療的重要依據，但微量稀釋法等常規檢測方法通常需要20 h以上，耗時較長。而引起感染的鮑曼不動桿菌往往多重耐藥，對于這類菌株常規藥敏檢測不僅周期長，而且受試驗藥物有限，往往不能滿足臨床需要，給臨床治療帶來很大困難。FCM能夠對細胞(或微粒)的生物學性狀及功能狀態進行快速、大量地定性或定量檢測，在細胞研究上應用廣泛。近年來，有研究將FCM用于細菌檢測，FCST也逐漸得到了研究和發展[11]。建立一種FCM快速檢測鮑曼不動桿菌MIC的方法可以為臨床選擇抗菌藥物提供快速、準確的參考，并且可以擴大藥敏試驗抗菌藥物選擇的范圍，為臨床合理應用抗菌藥物更好地提供參考。此外，建立該檢測方法具有加強對多重耐藥鮑曼不動桿菌監測的意義。

經抗菌藥物處理后的細菌，以PI等特定的熒光染料染色，并通過FCM檢測熒光強度，可以判斷其存活狀態，進而推斷MIC。PI屬于膜非滲透性熒光染料，價格較低，是FCST檢測理想的熒光染料。PI相對分子質量較大，正常情況下不能進入細胞膜完整的活細菌體內，然而當細胞受損害或壞死、外膜完整性破壞，PI即可進入細胞、嵌入到DNA的堿基對中，并且熒光強度明顯增強。本研究選擇PI作為熒光染料對66株鮑曼不動桿菌進行FCST檢測，并與常規方法進行比較。藥物敏感細菌因受抗菌藥物作用而損傷或壞死，導致細胞膜缺損，可被PI染色。PI進入菌細胞內嵌入細菌DNA中。FCM檢測時，PI在激光的激發下可發出紅色熒光(激發光譜300～380、440～580 nm，發光光譜560～680 nm)。本研究使用EPICS-XL型流式細胞儀，激發光為488 nm的氬離子激光，儀器中第3個光電倍增管能檢測PI發出的熒光信號(FL3)。既往研究多采用MFIx推斷MIC來反映細菌對藥物的敏感性。但培養基中顆粒狀物質熒光干擾、儀器工作狀態等多種因素均可影響MFIx，使其欠穩定。本試驗選擇檢測細菌在抗菌藥物作用后PI%的變化來推斷MIC、判斷細菌對藥物的敏感性。結果顯示，所有66株被檢鮑曼不動桿菌的藥敏結果與微量稀釋法及臨床使用的VITEK儀檢測結果完全一致。常規藥敏試驗細菌與藥物共同孵育培養20 h以上才能判讀結果，而FCST不依賴細菌大量繁殖，僅需5 h左右即可獲得結果，大大縮短了試驗時間。并且，由于被測菌與藥物共同孵育時間較短，藥敏結果不易受抗菌藥物誘導耐藥的影響。此外，由于是通過流式細胞儀逐個測定藥物對采集的菌細胞個體生長的影響、了解細菌的存活狀態，FCST還可以檢測到細菌群體中具有藥敏異質性的菌細胞。本試驗表明，FCST用于鮑曼不動桿菌體外抗菌藥物藥敏檢測具有快速、敏感的優點。

FCST精確、客觀，便于自動化和標準化。近年來隨著國內FCM在臨床檢驗多個領域的廣泛應用，相信該技術在快速細菌藥敏試驗方面也將發揮其應有價值。

[1]盧雅敏，鄒安慶，侯佳惠，等．鮑曼不動桿菌對頭孢哌酮/舒巴坦的體外藥敏試驗結果評價[J]．中國抗生素雜志，2011，36(11)：872-874．

[2]崔俊昌，宋秀杰．不同MH瓊脂對于替加環素對鮑曼不動桿菌藥敏結果的影響[J]．中國藥物應用與監測，2012，9(2)：84-86．

[3]Suller MT,Lloyd D.Fluorescence monitoring of antibiotic-induced bacterial damage using flow cytometry[J].Cytometry,1999,35(3):235-241.

[4]Favel A,Peyron F,De Méo M,et al.Amphotericin B susceptibility testing of Candida lusitaniae isolates by flow cytofluorometry:comparison with the Etest and the NCCLS broth macrodilution method[J].J Antimicrob Chemother,1999,43(2):227-232.

[5]葉應嫵，王毓三，申子瑜．全國臨床檢驗操作規程[M]．3版．南京：東南大學出版社，2006：890-920．

[6]朱永澤，胡慶豐，呂火烊，等．FCM快速檢測假絲酵母菌藥物敏感性方法的建立及應用[J]．中華微生物和免疫學雜志，2013，33(11)：850-855．

[7]夏曉華，陸淼泉．流式細胞術應用于金黃色葡萄球菌體外藥敏試驗的初步研究[J]．中國人獸共患病雜志，2003，19(4)：50-53．

[8]倪語星，糜琛蓉．細菌耐藥現狀與耐藥細菌的預防控制策略[J]．中華檢驗醫學雜志，2012，35(8)：682-684．

[9]董杰，葉曉光．泛耐藥鮑曼不動桿菌感染臨床治療的研究進展[J]．廣東醫學，2010，31(17)：2312-2314．

[10]王振，黃文祥，辛小娟，等．泛耐藥鮑曼不動桿菌醫院感染流行病學研究[J]．第三軍醫大學學報，2011，33(21)：2244-2248．

[11]Steen HB.Flow cytometry of bacteria:glimpses from the past with a view to the future[J].J Microbiol Methods,2000,42(1):65-74.

Preliminary study on the sensitivity test of Acinetobacter baumannii in vitro by flow cytometry

ZHAOXuhong,SHENJuying,CAIHuiping,CHENLuyi,LIZhi,XULong△

(DepartmentofClinicalLaboratory,YangpuHospital,TongjiUniversity,Shanghai200090,China)

ObjectiveTo investigate the clinical application significance of flow cytofluroometric(FCM) antibiotic susceptibility test for A.baumannii in vitro.MethodsThe sensitivity to Ampicillin/Sulbactam,Levofloxacin,Meropenem,Cefotaxime of an Escherichia coli standard strain and 66 isolates of A.baumannii were tested with FCM by using propidium iodide as a fluorescent probe.The survival rates of the bacteria in the culture after treatment with different dosages of the antibiotics were determined according to the fluorescence strength.The MIC value of the antibiotics against the 66 strains were judged with FCM,compared with microdilution and VITEK methods.ResultsThe antibiotic resistant strains number of sultamicillin,levofloxacin,meropenem and cefotaxime sodium were 35,30,13 and 38 respectively in flow cytofluorometric antibiotic sensitivity test(FCST) of 66 strains of A.baumannii.There was no significant difference(P>0.05) compared with the antibiotic susceptibility results by the methods of VITEK instrument and microdilution by measuring withχ2test respectively.ConclusionThe established method of FCST for A.baumannii is suitable for dectecting bacterial drug-sensitivity,which is more rapid,accurate and objective.

flow cytofluorometric antibiotic test(FCST);acinetobacter baumannii;sultamicillin;levofloxacin;meropenem;cefotaxime

趙旭鴻，女，主管技師，主要從事臨床實驗室診斷研究。△

,E-mail：ypxulong@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.18.019

A

1673-4130(2016)18-2555-03

2016-03-14

2016-05-22)