ERCC1基因多態性與肝癌患者易感性分析*

李艷秋，趙惠柳，歐　超，李美琴，利基林，朱　波

(廣西醫科大學附屬腫瘤醫院檢驗科，南寧 530021)

?

·論著·

ERCC1基因多態性與肝癌患者易感性分析*

李艷秋，趙惠柳#，歐超，李美琴，利基林，朱波△

(廣西醫科大學附屬腫瘤醫院檢驗科，南寧 530021)

目的探討切除修復交叉互補基因1(ERCC1)-4533/8092位點單核苷酸多態性(SNPs)與廣西壯族人群肝癌易感性之間關系。方法通過聚合酶鏈反應限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)方法檢測88例原發性肝癌患者和82例健康對照者的ERCC1-4533/8092基因多態性。結果ERCC1-4533位點的基因分型在病例組和對照組的頻數分布差異無統計學意義(P>0.05)，ERCC1-8092位點的基因分型在病例組和對照組的頻數分布差異具有統計學意義(P<0.05)。與攜帶ERCC1-8092 CC基因型的個體相比，攜帶ERCC1-C8092 CA/AA基因型的個體具有更高的肝癌易感性(CA：OR=2.556，95%CI：1.345～4.855；AA：OR=8.667，95%CI：1.000～75.092)。以攜帶ERCC1-8092 C等位基因作為參照，攜帶ERCC1-C8092 A等位基因可以增加原發性肝癌的發病危險性(OR=2.387，95%CI：1.428～3.992)。結論ERCC1-8092位點基因多態性與廣西壯族人群肝癌易感性有關。

ERCC1；原發性肝癌；基因多態性；易感性

原發性肝癌的發生發展是1個長期并且復雜的過程，原發性肝癌不但是嚴重危害人類生命健康的惡性腫瘤，且初期的臨床癥狀不明顯，因此很多患者在確診的時候已經處于原發性肝癌晚期，只有30%患者通過如手術切除、肝移植、經皮消融等方法治愈。近年在我國發病率呈上升趨勢，因此原發性肝癌的早期診斷變得越來越重要[1-2]。許多研究表明，基因多態性可能和某些DNA修復基因的功能有關，這些不同的基因多態性可能與不同癌癥的易感性有關，所以，分子水平的疾病診斷可能對腫瘤的早期診斷及腫瘤的個性化治療和預后判斷做出一定的貢獻[2]。切除修復交叉互補基因1(ERCC1)是核苷酸切除修復途徑(NER)的關鍵酶，其與特異性核酸內切酶DNA修復缺乏互補酶F(XPF)結合形成異源性二聚體結構，具有識別損傷并切除5′端的雙重作用[3-4]。有研究表明，ERCC1基因多態性可以影響核苷酸切除修復過程使其功能異常，基因組的不穩定性增加，這可能導致多種腫瘤發生[5]。因此，本研究將對ERCC1-4533/8092的多態性與廣西壯族人群的原發性肝癌易感性之間的關系進行探討。

1　資料與方法

1.1一般資料病例組選取2015年7～12月在本院病理組織學及影像學確診未經治療的原發性肝細胞癌88例，其中女16例，男72例；平均年齡(51.375±11.243)歲。對照組選自同醫院同期住院的非腫瘤患者82例(臨床檢查、檢驗結果均無異常)，其中，女15例，男67例；平均年齡(53.341±15.912)歲。病例組和對照組在年齡和性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)。所有入選研究對象均為廣西壯族人。

1.2儀器與試劑小量全血基因組DNA快速提取試劑盒、dNTPs由北京艾德萊生物科技有限公司提供；Taq DNA聚合酶、PmaCⅠ、Mbo Ⅱ由日本TaKaRa公司提供；引物由上海生工生物工程有限公司合成；瓊脂糖由西班牙Biowest公司提供；ProFlex PCR儀(美國Life Techonlogies公司)；Universal Hood Ⅲ凝膠成像系統(美國Bio-rad公司)；DYCP-31DN電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1全血DNA提取抽取受檢者外周靜脈血2～3 mL置于EDTA 抗凝管中，按照試劑盒說明書嚴格操作，使用小量全血基因組DNA快速提取試劑盒提取標本中的DNA。經核酸濃度測定儀測量濃度后，A260/A280比值在1.8～2.0視為DNA純度合格，儲存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2ERCC1 4533/8092位點基因多態性分析采用聚合酶鏈反應限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)技術對ERCC1-4533/8092位點基因多態性進行分析。PCR反應體系共25 μL，含5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL，DNA模板1 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10×PCR buffer(Mg2+Plus)2.5 μL，滅菌雙蒸水17 μL。引物設計參考文獻[6-7]。4533位點：上游引物：5′-AGA TGT CCT CTG CTC ACC CC-3′，下游引物：5′-GGG AGA ACA AAG TGG CTG GA-3′，PCR反應過程為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，61 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環，72 ℃再延伸10 min。目的產物長379 bp。8092位點：上游引物：5′-ACA GTG CCC CAA GAG GAG AT-3′，下游引物：5′-AGT CTC TGG GGA GGG ATT CT-3′，PCR反應過程為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性45 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環，72 ℃再延伸10 min，目的產物長204 bp。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后在紫外線燈下確認為目的條帶，取10 μL擴增產物分別與10 U限制性內切酶PmaCⅠ(ERCC1-4533)/Mbo Ⅱ(ERCC1-8092)混勻后置于37 ℃水浴箱中過夜進行酶切反應。酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后在紫外線燈下分析結果。為保證基因多態性分型的準確性，隨機抽取20%的標本進行重復試驗，結果與第1次試驗一致。

1.4統計學處理以t檢驗和χ2檢驗統計分別分析計量資料和計數資料。對照組ERCC1-4533/8092基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡采用χ2檢驗。應用非條件Logistic回歸計算ERCC1-4533/8092基因型分布的比值比(OR)及其95%可信區間(95%CI)評價不同基因型和等位基因與肝癌易感性之間的相關性。所有統計檢驗均為雙側檢驗，當P<0.05時認為差異具有統計學意義。采用SPSS17.0統計軟件錄入和分析數據。

2　結　　果

2.1ERCC1-4533/8092位點的PCR擴增產物及酶切產物分析ERCC1-4533位點PCR擴增產物片段大小為379 bp，經限制性內切酶PmaC Ⅰ酶切后可出現3種情況。基因型為純合子GG時電泳結果出現174、205 bp 2條帶，基因型為雜合子GA時電泳結果出現74、205、379 bp 3條帶，基因型為純合子AA時電泳結果出現379 bp 1條帶。ERCC1-8092位點PCR擴增產物片段大小為204 bp，經限制性內切酶Mbo Ⅱ酶切后可出現3種情況。基因型為純合子CC時電泳結果出現204 bp 1條帶，基因型為雜合子CA時電泳結果出現204、116、88 bp 3條帶，基因型為純合子AA時電泳結果出現116、88 bp 2條帶。見圖1、2。

2.2Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗為了檢驗ERCC1-4533/8092位點基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，對對照組的ERCC1-4533/8092位點基因型分布進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，檢驗結果顯示，對照組的ERCC1-4533/8092位點基因型分布的觀察數和預期數之間的差異無統計學意義(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，對照組標本具有群體代表性。見表1。

2.3ERCC1-4533/8092基因型及等位基因分布頻率比較和肝癌易感性分析ERCC1-4533位點的基因分型的頻數分布在病例組和對照組差異無統計學意義(P>0.05)，ERCC1-8092位點的基因分型的頻數分布在病例組和對照組兩組之間差異有統計學意義(P<0.05)。經非條件Logistic回歸分析，以ERCC1-8092 CC基因型作為參照，ERCC1-C8092 CA基因型可以增加原發性肝癌的發病危險性(OR=2.556，95%CI：1.345～4.855)，ERCC1-C8092 AA基因型可以增加原發性肝癌的發病危險性(OR=8.667，95%CI：1.000～75.092)。以ERCC1-8092 C等位基因作為參照，ERCC1-C8092 A等位基因可以增加原發性肝癌的發病危險性(OR=2.387，95%CI：1.428～3.992)。見表2。

注：M表示100 bp DNA Marker Ladder；1表示ERCC1-4533 PCR擴增產物；2表示純合子AA基因型：379 bp；3表示雜合子GA 基因型：174、205、379 bp；4表示純合子GG基因型：174、205 bp。

圖1ERCC1-4533基因多態性2%瓊脂糖凝膠電泳結果分析

注：M表示100 bp DNA Marker Ladder；1表示ERCC1-8092 PCR擴增產物；2表示純合子AA基因型：116、88 bp；3表示雜合子CA基因型：204、116、88 bp；4表示純合子CC基因型：204 bp。

圖2　ERCC1-8092基因多態性2%

表2　　病例組與對照組ERCC1-4533/8092基因型及等位基因分布頻率比較

續表2　　病例組與對照組ERCC1-4533/8092基因型及等位基因分布頻率比較

注：與對照組相比，*P>0.05，#P<0.05。

3　討　　論

正常細胞主要通過核苷酸切除修復途徑(NER)進行DNA損傷修復，而ERCC1是核苷酸切除修復途徑中的關鍵基因。ERCC1基因最初是由HeLa細胞克隆得到，位于人類第19號(19q13.2-3)染色體上，編碼含297個氨基酸的ERCC1蛋白[8-9]。單核苷酸多態性(SNPs)是指基因水平上由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性，在人群中的發生頻率大于1%[10]。ERCC1基因多態性可能影響ERCC1 mRNA表達或穩定及蛋白質功能，可能使核苷酸切除修復途徑功能受影響，導致基因組的不穩定性增加，進而產生腫瘤或其他疾病發生的惡性表型行為。有研究表明，ERCC1基因多態性與非小細胞肺癌、胃癌、卵巢癌等多種腫瘤的發病機制、對鉑類等抗腫瘤藥物的反應性及預后有密切關系[11-13]。

目前關于ERCC1-4533/8092位點基因多態性與原發性肝癌易感性關系的報道還比較少，其位點是否存在多態性且與原發性肝癌易感性是否有關尚不能確定。藍永洪等[8]的研究表明，海南人群中人類ERCC1-4533G/A存在多態性。鄭霄雁[14]的研究結果顯示， ERCC1-4533/8092位點存在基因多態性，并且這2個位點基因多態性均與原發性肝癌的發生可能有關。在本次病例對照研究中，作者分析了ERCC1-4533/8092 2個位點基因多態性與廣西壯族人群原發性肝癌易感性之間的關系，結果表明ERCC1-4533位點的基因分型的頻數分布在病例組和對照組之間差異無統計學意義(P>0.05)，ERCC1-8092位點的基因分型和等位基因的頻數分布在病例組和對照組兩組之間差異有統計學意義(P<0.05)。非條件Logistic回歸分析結果顯示，ERCC1-8092位點的A等位基因可能是廣西壯族人群原發性肝癌發生的危險因素，攜帶ERCC1-8092 A等位基因的個體患原發性肝癌的危險性是ERCC1-8092 C等位基因的2.387倍(OR=2.387，95%CI：1.428～3.992)。然而，由于本次研究收集的對象數量偏少并僅限于廣西壯族人群且只針對原發性肝癌這1種腫瘤進行探討，因此，ERCC1-4533/8092基因多態性是否對原發性肝癌的易感性產生影響，是否與肝臟其他相關性疾病有關，需進一步擴大樣本數量，擴大疾病范圍，在不同地區、不同人群中進行更深一步的探討。

原發性肝癌在世界腫瘤相關死亡中排名第2位，有數據顯示目前中國發病人數約占全球的原發性肝癌50%[15]。廣西是中國原發性肝癌的高發區，同時也是壯族人群聚集地[16]。而ERCC1基因多態性又與鉑類化療藥物的耐藥性有關，因此對廣西壯族人群的ERCC1基因多態性進行研究將對原發性肝癌的發病機制、基因水平的疾病診斷和個性化治療及預后判斷具有重要意義。

[1]Llovet JM，Bruix J.Systematic review of randomized trials for unresectable hepatocellular carcinoma：Chemoembolization improves survival[J].Hepatology，2003，37(2)：429-442.

[2]朱薇，葛君琍，張利強，等.AFP、CEA、CA199、CA-125聯合檢測對肝癌、肝硬化診斷的臨床價值[J].國際檢驗醫學雜志，2012，33(15)：1902-1904.

[3]Gao H，Ge RC，Liu HY，et al.Effect of ERCC1 polymorphism on the response to chemotherapy and clinical outcome of non-small cell lung cancer[J].Genetics and Molecular Research，2014，13(4)：8997-9004.

[4]Ueda S，Shirabe K，Morita K，et al.Evaluation of ERCC1 expression for cisplatin sensitivity in human hepatocellular carcinoma[J].Ann Surg Oneol，2011，18(4)：1204-1211.

[5] Niedernhofer LJ，Odijk H，Budzowska M，et al.The structure-specific endonuclease Ercc1-Xpf is required to resolve DNA inter strand cross-link-induced double-strand breaks[J].Mol Cell Bion，2004，24(13)：5776-5787.

[6]Metzger R.Pharmacogenetics and the practice of medicine[J].Nature，2003，405：857-865．

[7]王敬慧，張權，張卉，等.ERCC1基因多態性與晚期非小細胞肺癌患者鉑類化療療效的關系[J].中國肺癌雜志，2010，13(4)：337-341.

[8]藍永洪，鄭小桃，蔡望偉，等.海南人群中人類ERCC1-4533G/A多態性的研究[J].中國熱帶醫學，2006，6(8)：1377-1378.

[9]Westerveld A，Hoeijmakers JH，van Duin M，et al.Molecular cloning of a human DNA repair gene[J].Nature，1984,310(5976)：425-429.

[10]van Duin M，de Wit J，Odijk H，et al.Molecular characterization of the human excision repair gene ERCC-1： cDNA cloning and amino acid homology with the yeast DNA repair gene RAD10[J].Cell， 1986,44(6)：913-923.

[11]房克華，常曉天.單核苷酸多態性與腫瘤遺傳易感性的研究進展[J].中華腫瘤防治雜志，2011，18(2)：151-155.

[12]Mo J，Luo M，Cui J，et al.Prognostic value of ERCC1 and ERCC2 gene polymorphisms in patients with gastric cancer receiving platinum-based chemotherapy[J].Int J Clin Exp Pathol，2015，8(11)：15065-15071.

[13]齊冰麗，李琰，王娜，等.ERCC1基因多態性與卵巢上皮性癌患者鉑類藥物化療敏感性及預后的關系[J].中華婦產科雜志，2013，48(11)：847-852.

[14]鄭霄雁.修復基因ERCC1多態性與肝癌易感性的關系[D].福建：福建醫科大學，2008：19-20.

[15]Torre LA,Bray F,Siegel RL,et al.Global cancer statistics，2012[J].CA Cancer J Clin,2015,65(2)：87-108.

[16]覃彥平，秦雪，曹昭，等.IL-23R rs17375018單核苷酸多態性與廣西肝癌人群的相關性[J].廣東醫學，2014，35(5)：674-676.

The relationship on polymorphisms of ERCC1-4533/8092 and the susceptibility of hepatocellular carcinoma*

LIYanqiu，ZHAOHuiliu#，OUChao，LIMeiqin，LIJilin，ZHUBo△

(DepartmentofLaboratory，AffiliatedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning，Guangxi530021，China)

ObjectiveTo investigate the relationship on the excision repair cross complementing gene 1(ERCC1)-4533/8092 site single nucleotide polymorphisms(SNPs) and the susceptibility to hepatocellular carcinoma(HCC) in Guangxi Zhuang population.MethodsPolymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) method was used to detect the ERCC1-4533/8092 gene polymorphism in 88 cases with primary liver cancer and 82 cases of normal controls.ResultsThere was no difference in the frequency distribution of ERCC1-4533 in the case group and the control group,the frequency distribution of the ERCC1-8092 in the case group and the control group was different(P<0.05).Compared with ERCC1-8092 CC，ERCC1-C8092 CA/AA had higher risk of primary hepatocellular carcinoma(CA：OR=2.556，95%CI：1.345-4.855；AA：OR=8.667，95%CI：1.000-75.092).ERCC1-8092 C allele as a reference，ERCC1-8092 A allele can increase the risk of primary liver cancer(OR=2.387，95%CI：1.428-3.992).ConclusionThe genetic polymorphisms of ERCC1-8092 sites are associated with susceptibility to hepatocellular carcinoma in Guangxi Zhuang population.

ERCC1；primary hepatocellular carcinoma；polymorphisms；susceptibility

廣西自然科學基金資助項目(2012GXNSFAA053170)。

李艷秋，女，廣西醫科大學在讀研究生，主要從事血清腫瘤標志物檢驗、腫瘤基金分型等方面的研究。#共同第一作者：趙惠柳，女，副主任技師，主要從事腫瘤的診斷、發生、發展等方面的研究。△

，E-mail：bozhu196@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.18.007

A

1673-4130(2016)18-2523-03

2016-04-03

2016-06-11)