健脾益氣攝血顆粒對(duì)脾氣虛型慢性免疫性血小板減少癥血小板抗體及血清IL-2,IL-10與FOXP3表達(dá)的影響

吳玉霞，袁　忠,黃志惠,馬西虎,費(fèi)　飛

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健脾益氣攝血顆粒對(duì)脾氣虛型慢性免疫性血小板減少癥血小板抗體及血清IL-2,IL-10與FOXP3表達(dá)的影響

吳玉霞1，袁忠2,黃志惠1,馬西虎1,費(fèi)飛1

血小板減少；血小板；免疫學(xué)；白細(xì)胞介素2；白細(xì)胞介素10；DNA結(jié)合蛋白質(zhì)類；中西醫(yī)結(jié)合治療

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia,ITP)是臨床常見的一種自身免疫性疾病，以出血和血小板減少為主要特征，大約占臨床出血性疾病的30%；其主要類型為慢性免疫性血小板減少癥(chronic immune thromboaytopenia,CITP)，多見于成年女性，男女比例為1∶3。研究表明，ITP發(fā)病與細(xì)胞免疫和體液免疫功能紊亂導(dǎo)致血小板破壞過多和生成減少相關(guān)。中醫(yī)從脾論治在治療出血性疾病方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，取得良好療效[1-2]。因此，本研究觀察健脾益氣攝血顆粒對(duì)脾氣虛型CITP血小板抗體及血清白細(xì)胞介素-2(IL-2),IL-10與FOXP3表達(dá)的影響，并初步探討其作用機(jī)制。

1　對(duì)象與方法

1.1對(duì)象選取2013年8月—2015年10月血液科符合入選病例標(biāo)準(zhǔn)的CITP門診及住院患者 40例，采用隨機(jī)對(duì)照方法，即按隨機(jī)化方法將入選患者分為健脾益氣攝血聯(lián)合強(qiáng)的松治療組(20例)和單用強(qiáng)的松治療對(duì)照組(20例)。其中，治療組男性8例、女性12例，年齡(49.1±15.0)歲(16.5～78)歲；對(duì)照組男性9例、女性11例，年齡(48.5±16.0)歲(15.6～76歲)。2組患者性別、年齡及血小板計(jì)數(shù)情況比較,差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡16～78歲，性別不限；(2)符合CITP診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；(3)符合脾氣虛證候診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；(4)血小板計(jì)數(shù)輕重分級(jí)為輕度至重度上限(24×109L-1)，出血程度為輕度至中度。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重心、腦、肝、腎疾病；(2)精神病患者；(3)妊娠期或哺乳期患者；(4)合并其他嚴(yán)重疾病如嚴(yán)重的糖尿病、高血壓并發(fā)癥患者；(5)已知對(duì)受試藥物(單味)過敏者。

1.2方法

1.2.1治療對(duì)照組：?jiǎn)斡脧?qiáng)的松，初始劑量按每天1～1.5 mg/kg，早8點(diǎn)頓服，治療有效后可考慮減量，療程為21 d；治療組在與對(duì)照組使用相同強(qiáng)的松治療基礎(chǔ)上加服健脾益氣攝血顆粒(配方：黃芪、黨參、茯苓、白術(shù)、阿膠、茜草、炙甘草)，每次1袋，每日2次，療程也為21 d。

1.2.2觀察指標(biāo)治療前后2組血小板計(jì)數(shù)、骨髓產(chǎn)血小板巨核細(xì)胞數(shù)、血小板抗體、血清IL-2、IL-10及FOXP3 mRNA表達(dá)變化。

1.2.3檢測(cè)方法(1)對(duì)照組和治療組患者治療前后抽取外周血，采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(CD3700型,美國(guó)雅培公司)檢測(cè)上述指標(biāo)；(2)治療前后采用骨髓穿剌方法采集骨髓做細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)；(3)用流式細(xì)胞儀(FACS Calibur型,美國(guó)BD公司)分析治療前后抗血小板抗體。(4)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清IL-10、IL-2水平，試劑盒購(gòu)自上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司。(5)FOXP3 mRNA表達(dá)：治療前后患者在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下，抽取肘部5 mL靜脈血液，取血清3 mL放入-80 ℃冰箱。采用熒光定量實(shí)時(shí)PCR測(cè)定，應(yīng)用Trizol(美國(guó)Biomed公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Fermantas公司),GAPDH及FOXP3上下游引物(上海生工生物工程公司合成)，根據(jù)GenBank中FOXP3和GAPDH基因序列應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)FOXP3和GAPDH引物序列：

FOXP3(擴(kuò)增產(chǎn)物180 bp):

上游引物:5′-GAGGAACTCTGGGAATGTG-3′

下游引物:5′-TGACCAAGGCTTCATCTGTG-3′

GAPDH(擴(kuò)增產(chǎn)物145 bp):

上游引物:5′ -AGT-GGGTGTCGCTGTTGA-3′

下游引物:5′-GACCTGACCTGCCGTCTA-3′

熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(QPS 201，上海東洋紡生物科技有限公司)，熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀。

(MX 3005P，美國(guó)Stratagene公司)

1.4結(jié)果

1.4.12組患者治療前后血小板計(jì)數(shù)、骨髓巨核細(xì)胞數(shù)及產(chǎn)血小板巨核細(xì)胞比較治療后，對(duì)照組和治療組血小板水平及產(chǎn)血小板巨核細(xì)胞數(shù)較治療前均有提升(P<0.05)；但2組治療后比較，治療組優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)，說明中藥聯(lián)合強(qiáng)的松治療優(yōu)于與單用激素治療組(表1)。

1.4.22組患者治療后血小板抗體比較治療后，對(duì)照組和治療組血小板抗體較治療前均有降低，但對(duì)照組治療前后比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而治療組治療前后比較,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2組患者治療后血小板抗體比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表12組患者治療前后PLT、產(chǎn)血小板巨核細(xì)胞數(shù)比較

Tab 1Comparisons of PLT、bone marrow generating platelet megakaryocyte number between two groups before and after treatment

n=20.PLT:血小板計(jì)數(shù).同組內(nèi)與治療前比較，☆:P<0.05; 2組治療后比較，★:P<0.05.

1.4.32組患者治療前后血清IL-2,IL-10及FOXP3 mRNA表達(dá)比較對(duì)照組患者血清IL-2,IL-10及FOXP3 mRNA表達(dá)治療前后比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，治療組治療前后及與對(duì)照組治療后比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

表2　2組患者血小板抗體比較

n=20.PAIgG:抗IgG血小板相關(guān)抗體；PAIgA:抗IgA血小板抗體；PAIgM:抗IgM血小板抗體.同組內(nèi)與治療前比較，☆:P<0.05; 2組治療后比較，★:P<0.05.

表3　2組治療前后血清IL-2,IL-10及FOXP3 mRNA表達(dá)比較

n=20.IL-2:白細(xì)胞介素-2;IL-10:白細(xì)胞介素-10.同組內(nèi)與治療前比較，☆:P<0.05;2組治療后比較，★:P<0.05.

2　討　論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，脾為后天之本，氣血生化之源，且脾主統(tǒng)血，使血行脈中而不妄行。因此，按照中醫(yī)學(xué)理論，“脾胃為后天之本，氣血生化之源”與“脾統(tǒng)血”，其治療以健脾益氣攝血為治則，既能生血又可攝血，因此從脾論治脾虛型CITP取得良好療效[5]，但其作用機(jī)制尚不明確。

ITP是一種以單純性血小板減少為特征的獲得性免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。現(xiàn)代研究表明，ITP既包括體液免疫失調(diào)，也包括細(xì)胞免疫紊亂，是一種具有異質(zhì)性疾病。大量研究證實(shí)，血小板相關(guān)自身抗體產(chǎn)生與B細(xì)胞分化、增殖與體液免疫相關(guān)，它使外周血血小板壽命縮短及骨髓巨核細(xì)胞產(chǎn)血小板不良，引起血小板減少，加重自發(fā)性出血，臨床檢查可發(fā)現(xiàn)多數(shù)ITP患者存在血小板膜糖蛋白特異性抗體如抗GPⅡb/Ⅲa抗體和抗PIb/IX抗體[7-8]。在ITP發(fā)病過程中，參與ITP發(fā)病的細(xì)胞因子有兩類，即Thl型和Th2型。Thl細(xì)胞能分泌IL-2，IL-3等，主要參與細(xì)胞免疫；Th2細(xì)胞分泌IL-3，IL-4，IL-10等，以IL-10為主要特征，主要參與體液免疫。有研究表明，在細(xì)胞免疫方面，ITP患者尚存在異常數(shù)量和功能CD4+CD25+Treg;CD4+CD25+Treg在機(jī)體中發(fā)揮抑制自身免疫增強(qiáng)免疫耐受作用，而控制CD4+CD25+Treg的主要基因則是FOXP3，它可在CD4+CD25+Treg內(nèi)特異性地表達(dá)[9-10]。有研究證實(shí)，外周血FOXP3的表達(dá)在ITP患者中明顯減少，而上調(diào)FOXP3表達(dá)可使患者骨髓象及臨床表現(xiàn)明顯改善，據(jù)此推斷免疫耐受減低是由于FOXP3分子表達(dá)缺陷所致，這也為ITP發(fā)病的重要機(jī)制之一[11]。因此，可以通過觀察藥物能否通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、上調(diào)FOXP3表達(dá)、抑制血小板抗體生成而達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞及體液免疫及促進(jìn)骨髓巨核細(xì)胞成熟而發(fā)揮作用的。

健脾益氣攝血顆粒方中黃芪、黨參等為治療氣虛之主藥，共為君藥，白術(shù)補(bǔ)氣健脾，茯苓滲濕健脾，共為臣藥，阿膠、當(dāng)歸補(bǔ)血活血，共為佐藥，茜草涼血祛瘀止血為使藥。全方具有益氣健脾攝血、止血祛瘀生新之功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，黃芪的主要成分為黃芪多糖，可使特異性免疫和非特異性免疫的能力增強(qiáng)，提高造血干細(xì)胞的增殖能力;黨參具有調(diào)節(jié)細(xì)胞、體液免疫作用[12]；當(dāng)歸中具有當(dāng)量多糖、阿魏酸，有增強(qiáng)免疫、誘生干擾素的功能[13]。茜草中的有效成分有茜草雙酯，具有促進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨髓造血細(xì)胞增殖和分化作用，茜草尚有促進(jìn)血液凝固達(dá)到止血作用[14]。本研究通過檢測(cè)健脾益氣攝血顆粒聯(lián)合強(qiáng)的松治療CITP前后血小板計(jì)數(shù)、產(chǎn)血小板巨核細(xì)胞數(shù)目、血小板抗體、血清IL-2,IL-10及FOXP3 mRNA表達(dá)的變化，試圖初步探討其作用機(jī)制。結(jié)果顯示，單用強(qiáng)的松與健脾益氣攝血顆粒聯(lián)合強(qiáng)的松治療前后均能提高患者的血小板水平，促進(jìn)骨髓巨核細(xì)胞的分化成熟，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫耐受、維持免疫平衡狀態(tài)功能，但兩組治療后比較表明，健脾益氣攝血顆粒聯(lián)合強(qiáng)的松優(yōu)于單用強(qiáng)的松，說明健脾益氣攝血顆粒可能通過提高血清IL-2、IL-10水平，上調(diào)FOXP3 mRNA的表達(dá)，抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞活化和抗體生成而達(dá)到減少血小板破壞，促進(jìn)巨核細(xì)胞的成熟增加血小板生成而發(fā)揮作用。

[1]王志清.胃脾湯加減治療慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜的應(yīng)用[J].中國(guó)中醫(yī)急癥,2010,19(7):1157.

[2]馮自明.健脾湯治療血小板減少性紫癜23例觀察[J].中外健康文摘,2012,9(23):419-420.

[3]張之南,沈梯.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].3版.北京:科學(xué)出版社,2007.

[4]鄭曉萸.中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則「M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2002.

[5]許亞梅,賈玫,侯麗,等.陳信義教授治療難治性血小板減少性紫癜經(jīng)驗(yàn)介紹[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào):中醫(yī)臨床版,2011,18(5):2426.

[6]李天天,侯麗,張雅月,等.從脾論治免疫性血小板減少性紫癜的理論基礎(chǔ)與臨床實(shí)踐[J].北京中醫(yī)藥,2015,34(4):304-306.

[7]何飛,梁昌達(dá),潘曉芬,等.血小板相關(guān)抗體與兒童特發(fā)性血小板減少性紫癜轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性分析[J].中國(guó)小兒血液與腫瘤雜志,2011,16(10):225-227.

[8]張春梅.免疫性血小板減少癥患者淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)及其與血小板抗體、臨床特征的相關(guān)性研究[J].中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2012,15(10):1525-1526.

[9]Chang B H.ITP:Tregscome to the rescue[J].B1ood,2010,116(22):4388.

[10]Williams L M,Rudensky A Y.Maintenance of the Foxp3 dependent developmental program in mature regulatory T cells requires continued expression of Foxp3[J].Nat lmmunol,2007,8 (3):277.

[11]秦克力，楊金丹.紫癜圣愈散調(diào)節(jié)慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜外周血CTLA-4水平的研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2012,39(1):106.

[12]孫建寧.中藥藥理學(xué)[M].北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2006:218-219.

[13]沈映君.中藥藥理學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:920-926.

[14]楊連榮,周慶華,張哲峰,等.茜草的化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息,2007,24(1)：22.

(編輯：常志衛(wèi))

2016-04-11

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃973項(xiàng)目(2013CB531705)

新疆醫(yī)科大學(xué) 附屬中醫(yī)醫(yī)院，新疆8300111.血液科;2.腎病科

吳玉霞(1967-)，女，副主任醫(yī)師，中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)學(xué)碩士.Email:wyxymkyz@163.com

R341；R341.3；R446.6；R558.2

B

1672-4194(2016)04-0264-03