胃動蛋白1在EB病毒相關胃癌中的表達及其意義

林潔瓊，林賢東，鄭雄偉，胡　丹，陳　剛，應敏剛

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胃動蛋白1在EB病毒相關胃癌中的表達及其意義

林潔瓊，林賢東，鄭雄偉，胡丹，陳剛，應敏剛

目的研究EB病毒(EBV)感染與胃癌的相關性及胃動蛋白1(GKN1)表達與胃癌臨床病理特征、EBV感染的關系，為EBV相關胃癌的治療、控制和預防提供理論依據。方法胃腺癌患者104例，分析EBV感染與臨床病理特征的關系。采用免疫組織化學方法檢測GKN1在慢性胃炎組織、腸化胃黏膜、慢性胃潰瘍組織、原位癌及胃癌組織中的表達情況；應用實時定量PCR檢測胃癌及癌旁組織中GKN1 mRNA的表達水平與臨床病理特征的關系。結果EBV感染與胃癌Lauren’s分型和年齡密切相關(P<0.05)，而與患者的性別、腫瘤部位、病理類型及TNM分期無顯著相關性(P>0.05)。GKN1 mRNA在胃腺癌和癌旁組織中的表達水平差別具有統計學意義(P<0.05)，且GKN1 mRNA的低表達水平與腫瘤大小(P=0.012)、發生部位(P=0.022)及EBV感染(P=0.034)密切相關。結論GKN1可能是EBV相關胃癌潛在的腫瘤標志物。

皰疹病毒4型，人；胃腫瘤；腫瘤標記，生物學

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一[1]。我國屬胃癌高發區域，每年約有40萬新發胃癌患者，占世界總發病人數的42%，且新發胃癌患者呈年輕化趨勢[2]。因此，胃癌對我國國民的生命健康構成嚴重威脅。胃癌的發生受感染、遺傳、環境、精神和心理狀態等多種因素的影響，其發生和發展是多因素、多階段、多基因共同作用的結果[3]。EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染與胃癌的發生發展密切相關[4-5]，EBV相關胃癌(epstein-barrvirus-associated gastric carcinoma,EBVaGC)已逐漸被人們所了解和認知。然而，EBV感染與胃癌的關系尚不完全清楚。胃動蛋白1(gastrokine 1,GKN1)，又稱CAI1、AMP-18、foveolin或TFIZ2，位于染色體2p13.3，全長約6 kb，含有6個外顯子和5個內含子，是最新發現的表達于正常胃黏膜上皮的新型分泌蛋白，具有促進胃黏膜上皮細胞分裂和移行、維持胃黏膜完整和促進受損黏膜修復的功能[6]。Rui等研究結果表明，GKN1在胃癌組織和細胞系中表達明顯下調，GKN1具有抑制胃癌細胞體外和體內的增殖能力[7]，提示GKN1可能成為胃癌的特異性標記物或胃癌生長的抑制因子。但GKN1與EBVaGC的關系尚不清楚。本研究旨在通過研究EBV感染與胃癌的相關性，以及GKN1表達與胃癌臨床病理特征及EBV感染的關系，為EBVaGC的治療、控制和預防提供理論依據。

1　對象與方法

1.1對象收集2012年1月-2015年4月確診的胃癌根治標本104例，男性81例，女性23例，年齡中位數59歲(22～80歲)，其中<60歲57例，≥60歲47例。EBVaGC 41例，非EBVaGC 63例；非食管交界胃癌79例，食管交界胃癌25例；腸型胃癌33例，彌漫型胃癌71例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期31例，Ⅲ～Ⅳ期73例。

1.2方法

1.2.1組織芯片蠟塊制作使用10%中性福爾馬林固定胃癌切除標本，石蠟包埋，采用組織芯片制作機細針打孔的方法，從眾多的組織蠟塊(供體蠟塊)中采集數十至上百個圓柱形小組織(組織芯)，并將其整齊排列于另一空白蠟塊(受體蠟塊)中，制成組織芯片蠟塊。

1.2.2EBV原位雜交檢測將組織芯片蠟塊進行切片，烤片至少2 h，經二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水后滴加蛋白酶K消化約5 min，滴加EBV核酸探針(Epstein-Barr encoded RNA,EBER)雜交液，55 ℃恒溫箱中孵育90 min，后調至37 ℃孵育過夜。滴加一抗孵育30 min，滴加二抗孵育20 min。洗滌擦干，滴加辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)聚合物，反應30 min；擦干組織周圍水分，滴加1∶50 DAB試劑，顯色6 min，洗滌后用蘇木精復染，自來水沖洗5 min，切片經梯度酒精脫水干燥后采用中性樹膠封固，晾干后觀察。

1.2.3免疫組織化學染色將組織芯片蠟塊進行切片烤片后，采用高壓鍋抗原修復法；滴加GKN1一抗抗體(抗體濃度1∶1 600，美國Sigma公司)，4 ℃過夜；滴加二抗A試劑，37 ℃孵育2 h，滴加試劑B，DAB復合物顯色后蘇木精復染，自來水沖洗5 min，室溫干燥后使用梯度乙醇脫水，采用中性樹膠封片。陰性對照：以PBS代替一抗；陽性對照：已知GKN1陽性的正常胃黏膜組織。

1.2.4新鮮組織RNA提取并逆轉錄取30 mg新鮮胃癌及癌旁組織，在液氮環境下進行快速研磨，把組織勻漿轉移到無RNA酶的EP管中，其余步驟嚴格按照Trizol法提取新鮮組織的總mRNA，采用紫外分光光度儀測定每份樣本總RNA的OD260 nm/OD280 nm，以檢測其純度及濃度，同時進行1%瓊脂凝膠電泳檢測RNA的完整性。將稀釋好的RNA逆轉錄成cDNA，操作嚴格按照逆轉錄試劑盒說明書進行。

1.2.5實時熒光定量PCR分析根據引物設計原則設計實時熒光定量PCR引物。

目的基因GKN1基因(PCR產物為205 bp)：

上游：5’-GCCTGATGTACTCAGTCAACC-3’

下游：5’-TAGTTCTCCACCGTGTCTCC-3’

管家基因β-actin基因(PCR產物為236 bp)：

上游：5’-GCGTGACATTAAGGAGAAGC-3’

下游：5’-CCACGTCACACTTCATGATGG-3’

PCR反應體系為25 μL，反應條件：95 ℃預變性10 min→95 ℃變性15 s→60 ℃退火1 min→72 ℃延伸45 s，共40個循環。其中目的基因GKN1基因的退火溫度為65.3 ℃，管家基因β-actin基因的退火溫度為63 ℃。置于實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems ViiATM7 Real-Time PCR System，美國)進行實時定量擴增，采用內參基因進行校正檢測結果。

1.2.6定量PCR數據分析和修正以T-099癌組織表達為準(calibrator)，即它的表達量設為1，量化其他樣本的表達量，同時以β-actin為內參基因對目的基因的表達進行標準化；在調整基線循環(baseline)和計算閾值(threshold position)后，采用RQ=2-△△Ct法比較目的基因GKN1的相對表達量，儀器自動得出Ct值(threshold cycle)，所得的Ct值，運用相對定量的計算公式，計算得出RQ值，代表目的基因的相對表達量。為了便于統計，把RQ值取lgRQ進行分析[8]：

△Ct=CtGKN1-Ctβ-actin

△△Ct=△Ct-△CtT-099

RQ=2-△△Ct

2　結　果

2.1EBV感染與患者臨床病理特征的關系EBVaGC患者中，EBER陽性，具有低分化癌伴大量淋巴細胞浸潤等形態學特點(圖1)。EBV感染與Lauren’s分型及年齡密切相關(P=0.01，χ2=6.63；P=0.05，χ2=3.84，表2)，而與性別、腫瘤部位、病理類型及TNM分期無顯著相關性(P>0.05，表1)。

表1EBV感染與患者臨床病理學特征的關系

Tab 1Correlation between EBV infection andpathological features of gastric cancer

表中數據為n.EBV：EB病毒.同一指標內比較，☆：P<0.05.

2.2GKN1蛋白在胃黏膜病變過程中的表達免疫組織化學染色結果顯示，正常胃黏膜組織中，GKN1定位于胃黏膜柱狀上皮細胞的胞質，呈強陽性，而在腸化胃黏膜、慢性胃潰瘍、高級別上皮內腫瘤以及浸潤性腺癌中，GKN1均呈陰性(圖2)。

2.3GKN1 mRNA在胃癌及癌旁組織中的表達水平

應用實時定量PCR檢測結果如圖3，胃癌組織及相應的癌旁組織中，GKN1 mRNA表達水平的均值分別為0.56和2.36，二者間差別具有統計學意義(P<0.01)。相對于相應的癌旁組織，胃癌組織中GKN1 mRNA表達水平降低了63.5倍。GKN1在胃癌組織及相對應的癌旁組織的免疫組織化學結果與以上結果一致(圖4)。

2.4胃癌組織中GKN1 mRNA表達與臨床病理學特征的關系胃癌組織中GKN1 mRNA的表達水平及其分布如圖3，其與臨床病理學特征的關系見表2。GKN1 mRNA的低表達水平與腫瘤大小(P=0.012)、發生部位(P=0.022)及EBV感染(P=0.034)密切相關，且腫瘤直徑<5 cm的病例組GKN1 mRNA的表達水平是腫瘤>5 cm病例組的8.1倍；非食管胃交界病例組GKN1 mRNA的表達水平是食管胃交界病例組的9.1倍；EBVaGC組GKN1 mRNA的表達水平是非EBVaGC組的6倍。GKN1 mRNA的相對表達水平與性別、TNM分期、淋巴結轉移、浸潤程度及分化程度無明顯相關性(P>0.05)。

3　討　論

3.1GKN1表達與胃癌臨床病理特征的關系GKN1作為一種胃組織特異性蛋白，在正常胃黏膜組織中大量表達，而在胃癌及癌前病變組織中表達下調或缺失，具有維持胃黏膜的完整性和促進受損黏膜修復的功能，是一類潛在的抑癌基因[9]。本研究結果顯示，癌旁組織GKN1 mRNA表達水平明顯高于癌組織，表明GKN1在胃癌中普遍存在低表達或丟失現象。同時，免疫組織化學結果也顯示，在腸化生胃黏膜組織、胃潰瘍組織、胃高級別上皮內腫瘤組織及癌組織GKN1都出現低表達或缺失，表明在胃黏膜病變過程中GKN1出現缺失。這與Menheniott的研究結果一致[10]。另外，本研究還顯示，GKN1 mRNA的表達水平與腫瘤大小(P=0.012)密切相關，且腫瘤直徑<5 cm的病例組GKN1 mRNA的表達水平是腫瘤直徑>5 cm病例組的8.1倍，提示GKN1表達可能對腫瘤的生長具有抑制作用。Rui等研究結果表明，GKN1在胃癌組織和細胞系中表達明顯下調，GKN1具有抑制胃癌細胞體外和體內增殖的能力[7]，與筆者的研究結果一致。其他研究也顯示，GKN1與胃癌侵襲轉移密切相關，GKN1通過上調抗氧化酶、錳過氧化物歧化酶及過氧化氫酶含量，降低ROS水平，減少纖連蛋白、波形蛋白、β-catenin、slug、snail以及Cyclin D1的表達，從而抑制上皮-間質轉化EMT阻止腫瘤細胞的侵襲轉移[6]。以上結果提示，GKN1在胃癌的發生、發展中起重要作用，可能是胃癌早期診斷和篩查的一個潛在的分子標志物，并有可能成為胃癌的治療新靶點。

表2GKN1 mRNA的表達與臨床病理學特征的關系

Tab 2Correlation between tumor GKN1 mRNA expression and pathological features of gastric cancer

同一指標內比較，☆：P<0.05.

3.2GKN1表達與EBVaGC的關系EBV是一種DNA雙鏈病毒，長期慢性感染人類可引起鼻咽癌、傳染性單核細胞增多癥、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和T細胞淋巴瘤等[11]。研究表明，EBV也是重要的胃癌致病因子。EBVaGC約占所有胃癌病例的10%，預計每年有80 000新增的EBVaGC患者[12]。EBVaGC多發生于賁門及胃體部，呈潰瘍型，EBER陽性，具有低分化癌伴大量淋巴細胞浸潤等形態學特征[12]。筆者的研究結果顯示，EBV感染與胃癌Lauren’s分型及患者年齡密切相關。其他研究還表明，EBVaGC具有獨特的生物學行為，包括PIK3-CA通路突變、DNA超甲基化、PD-L1和PD-L2基因拷貝數增加等分子特征[13]。以上結果提示，EBV可能在胃癌發生、發展中扮演著重要角色。

本研究中，筆者分析發現，GKN1 mRNA的表達水平與EBV感染密切相關，病例組GKN1 mRNA的表達水平是對照組的6倍。近年來研究發現，EBV感染引起胃癌相關基因啟動子異常甲基化、基因功能異常、細胞抗凋亡作用以及胃局部微環境改變在EBVaGC的發生發展中發揮重要作用[5]。EBV的重要蛋白EBNA1可以直接結合到GKN1的啟動子，從而影響該基因表觀遺傳學改變[14]。以上結果提示，GKN1 mRNA的表達水平與EBVaGC密切相關。而EBVaGC是胃癌的一種特殊類型，它的形態特征及基因變化有別于其他類型的胃癌，但相關研究仍較少。下一步研究工作，筆者將在臨床病例研究的基礎上進行功能和機制的研究，明確GKN1在EBVaGC的作用機制。

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(編輯：何佳鳳)

The Expression and Significance of Gastrokine 1 in Epstein-Barr Virus Associated Gastric Cancer

LIN Jieqiong,LIN Xiandong,ZHENG Xiongwei,HU Dan,CHEN Gang,YING Mingang

Teaching Hospital of Fujian Medical University,Department of Pathology,Fujian Provincial Cancer Hospital,Fujian Provincial Key Laboratory of Translational Cancer Medicine,Fuzhou 350014,China

ObjectiveTo analyse the correlation of EBV infection to the gastric cancer and the relationship of the expression of gastrokine 1 (GKN1) in the gastric cancer with EBV infection and clinicopathologicalfeatures,for providing theoretical basis to the treatments,controls and preventions of Epstein-Barr virus associated gastric cancer(EBVaGC).Methods104 cases of gastric adenocarcinoma and adjacent tissue were collected to analyze the realationship between EBV infection and clinical pathological features of gastric cancer.The expression of GKN1 was detected by immunohistochemical method in chronic gastritis,intestinal metaplasia,chronic gastric ulcer cases,carcinoma in situ cases and gastric carcinoma.Meanwhile,the mRNA expression level of GKN1 in the 104 gastric cancer tissues and corresponding adjacent tissues were examined by real-time quantitative PCR and investigate the relationship between the expression level of GKN1 and the clinicopathological characteristics.ResultsThe EBV infection was closely correlated to Lauren’s subtype and the age (P<0.05),while there was no significant association between EBV infection and sex,tumor site,pathological classification and TNM stage(P>0.05).The difference between GKN1 mRNA expression in gastric carcinoma and adjacent tissues was statistically significant.The low expression level of GKN1 mRNA was closely related to tumor size (P=0.012),location (P=0.022),and the EBV infection(P=0.034).ConclusionsGKN1 may be a specific biomarker for EBVaGC.

herpesvirus 4,human; stomach neoplasms; tumor markers,biological

2016-03-28

國家臨床重點專科建設項目(2013-ZQN-JC-8)；福建省衛計委創新課題(2015-CX-7)；福建省衛計委中青年骨干人才培養項目(2015-ZQN-JC-7)

福建醫科大學 教學醫院、福建省腫瘤醫院 病理科，福建省腫瘤轉化醫學重點實驗室，福州350014

林潔瓊(1990-)，女，福建醫科大學2013級碩士研究生

鄭雄偉.Email:agu1960@126.com

R322.44；R735.2

A

1672-4194(2016)04-0237-05