薏苡仁油的質量分析

鄭　利，陳　丹，范世明，廖淑彬，黃　嬌，謝　平

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薏苡仁油的質量分析

鄭利，陳丹，范世明，廖淑彬，黃嬌，謝平

目的建立薏苡仁油的總酯量測定和薄層色譜鑒別以及氣相色譜含量測定法。方法采用容量滴定法測定薏苡仁油的總酯量；采用薄層色譜法鑒別薏苡仁油中的特征成分；采用氣相色譜法，經油酸和亞油酸經衍生化處理，以水楊酸甲酯為內標物按內標法計算油酸及亞油酸含量。結果薏苡仁油中總酯量以甘油三酯計，均不低于95%；薄層色譜鑒別斑點清晰，專屬性強；氣相色譜法定量分析油酸甲酯在0.054 4～1.087 2 mg/mL范圍內呈良好的線性關系，平均回收率為97.92%(RSD=1.24%，n=6)，亞油酸甲酯在0.041 5～1.050 8 mg/mL范圍內呈良好的線性關系，平均回收率為100.4%(RSD=2.23%，n=6)，3批薏苡仁油中油酸含量分別為59.59%,58.29%和58.67%，亞油酸含量分別為25.17%,24.31%和24.77%。結論建立的薏苡仁油總酯量測定法、薄層色譜鑒別法及氣相色譜(內標法)含量測定方法操作簡便，結果準確，可有效用于薏苡仁油的質量控制。

薏苡屬；甘油三酯類；色譜法，氣相；油酸；亞油酸；質量控制

薏苡仁是禾本科植物薏苡[Coix lacryma-jobi L.var.ma-yuen(Roman.) Stapf]的成熟種仁，具有健脾、補肺、清熱、利濕的功效[1-2]。薏苡仁油是從薏苡仁通過超臨界CO2萃取等技術所獲得，主要含有油酸、亞油酸、硬脂酸、棕櫚酸等成分，其中油酸與亞油酸含量較高，為主要活性成分，且是其易氧化的特征代表性成分[3]；薏苡仁油含甘油三酯達87%以上，其中主要成分有甘油三油酸酯、甘油三亞油酸酯等[4-6]。現代藥理學研究證明，薏苡仁油具有明顯的抗腫瘤作用，臨床上已被用作抗腫瘤輔助治療藥物。但薏苡仁油易氧化，具有不穩定性[7-8]。為有效控制薏苡仁油的質量，使其適用于后續制劑研究的原料，本研究擬建立薏苡仁油中的總酯量測定法及薄層色譜鑒別法，研究樣品衍生化前處理，建立衍生化氣相色譜法(內標法)測定薏苡仁油中特征成分油酸、亞油酸含量，為薏苡仁油從整體到特征成分的質量控制以及進一步深入開發薏苡仁油制劑提供實驗基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器氣相色譜儀及氫火焰離子化檢測器(Agilent 6890N，美國安捷倫科技公司)。

1.1.2試藥甘油三油酸酯對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111692-201002，含量99.7%)；薏苡仁油對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:111750-201102)；亞油酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111622-201203)；油酸甲酯(美國Fluka公司，供含量測定)；亞油酸甲酯(中國食品藥品檢定研究院，批號：111625-200502，供含量測定)；水楊酸甲酯[阿拉丁試劑(上海)有限公司，批號：29412，分析標準品，含量≥99.5%]；薏苡仁油(自制，委托廣州合誠三先生物有限公司加工[9])；其他試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1薏苡仁油含總酯量的測定精密稱取薏苡仁油約1.3 g，置250 mL錐形瓶中，精密加入乙醇制氫氧化鉀滴定液(0.5 mol/L)25 mL，加熱回流30 min，用乙醇10 mL沖洗冷凝管，放冷，加酚酞指示液1 mL，用鹽酸滴定液(0.5 mol/L)滴定至溶液粉紅色褪去，加熱至煮沸，如溶液又呈粉紅色，再繼續滴定至粉紅色褪去，同時做空白實驗。

1.2.2薏苡仁油的薄層色譜鑒別取薏苡仁油0.1 g，加2 mL石油醚(60～90 ℃)使溶解，作為薏苡仁油供試品溶液。另取亞油酸對照品、甘油三油酸酯對照品、薏苡仁油對照品適量，分別加石油醚制成每1 mL含亞油酸21.75 mg、甘油三油酸酯40.48 mg和薏苡仁油40.75 mg的溶液，作為各對照品溶液；分別取甘油三油酸酯對照品39.9 mg、亞油酸對照品40.6 mg，加石油醚2 mL使其溶解，制成每1 mL含甘油三油酸酯19.95 mg、亞油酸20.30 mg的混合對照品溶液。按照薄層色譜法《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B試驗，分別吸取對照品溶液、供試品溶液各2 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(25∶5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.5%香草醛-硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱約5 min，置紫外光燈(365 nm)下檢視。

1.2.3薏苡仁油中油酸與亞油酸的GC含量測定

1.2.3.1色譜條件與系統適用性試驗色譜柱 Agilent DB-WAX毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣N21.0 mL/min，空氣流量300 mL/min，氫氣流量30 mL/min，尾吹氣流量45 mL/min；檢測器FID，檢測器溫度250 ℃；進樣口溫度220 ℃；進樣量1 μL，分流進樣，分流比30∶1；柱溫190 ℃。

1.2.3.2對照品溶液的制備精密稱取油酸甲酯對照品27.18 mg，亞油酸甲酯對照品20.77 mg，分別用氯仿制成每1 mL含5.436 0 mg油酯甲酯、4.154 0 mg亞油酯甲酯的對照品溶液，即得。

1.2.3.3內標溶液的制備精密稱取水楊酸甲酯對照品128.52 mg，用氯仿制成每1 mL含5.140 8 mg水楊酸甲酯的內標溶液，即得。

1.2.3.4供試品溶液的制備取薏苡仁油50 mg，置50 mL圓底燒瓶中，加0.05% 2,6-二叔丁基對甲酚的四氫呋喃溶液1 mL，使其溶解，加5%(W/V)氯化氫甲醇溶液2 mL，在80 ℃水浴中回流2.5 h，放冷，移入20 mL具塞試管中，用5%氯化鈉溶液5 mL分次洗滌圓底燒瓶，洗滌液并入具塞試管中，用5 mL正己烷振搖萃取，正己烷層移入盛有2%碳酸氫鉀溶液4 mL的另一具塞試管中，振搖，分取正己烷層，水層再用正己烷萃提2次，每次5 mL，合并正己烷提取液，置50 mL圓底燒瓶中，在60 ℃水浴中減壓濃縮至干，殘渣用氯仿溶解并定量轉移至5 mL量瓶中，加氯仿稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.3.5專屬性試驗分別取油酸甲酯、亞油酸甲酯對照品溶液400 μL，置于5 mL量瓶，加入內標溶液500 μL，用氯仿稀釋至刻度，作為混合對照品溶液。取供試品溶液700 μL，置于5 mL量瓶，加入內標溶液500 μL，用氯仿稀釋至刻度，作為含內標供試品溶液。取空白溶劑、混合對照品溶液、含內標供試品溶液各1 μL，分別按“1.2.3.1”項下色譜條件測定。

1.2.3.6定量限考察取對照品溶液按一定稀釋倍數逐級稀釋，直至在“1.2.3.1”項色譜條件下能定量檢測出油酸甲酯與亞油酸甲酯量作為其最低定量限(S/N>10)。

1.2.3.7標準曲線的制備與線性關系考察精密吸取對照品溶液各50,100,200,400,800,1 000 μL，置于5 mL量瓶，分別加入內標溶液500 μL，用氯仿稀釋至刻度，得系列混合對照品溶液。分別吸取系列混合對照品溶液1 μL，注入氣相色譜儀，測定，以對照品與內標物的峰面積比(A對照品/A內標)為縱坐標，對照品的濃度(C對照品)為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.3.8精密度試驗取同一混合對照品溶液，連續進樣6次，以對照品與內標物的峰面積比(A對照品/A內標)計算RSD，評價精密度。

1.2.3.9穩定性試驗精密稱取薏苡仁油51.60 mg，按“1.2.3.5”及“1.2.3.1”項同法操作，制成含內標供試品溶液，4 ℃下放置，分別在0，2，4，6，8，12和24 h測定并計算油酸與亞油酸RSD值。

1.2.3.10重復性試驗分別取6份同一批薏苡仁油各約50 mg，精密稱定，按“1.2.3.5”及“1.2.3.1”項同法操作，測定，分別計算油酸、亞油酸的含量及其RSD值。

1.2.3.11加樣回收率試驗分別精密稱取6份已測含量的同一批薏苡仁油樣品(油酸含量為59.59%，亞油酸含量為25.17%)約25 mg，精密加入油酸甲酯及亞油酸甲酯對照品溶液，按“1.2.3.5”及“1.2.3.1”項同法操作，測定，計算回收率。

1.2.3.12樣品測定分別稱取6份3批薏苡仁油約50 mg，每批3份，精密稱定，按“1.2.3.5”及“1.2.3.1”項下同法操作，測定薏苡仁油中油酸與亞油酸的含量，并根據分子量換算得到樣品中所含的油酸及亞油酸的含量。換算公式如下：

2　結　果

2.1薏苡仁油含總酯量的測定采用滴定法測得3批薏苡仁油含總酯量以薏苡仁油甘油三酯計，分別為97.89%，97.02%和97.01%，RSD值為0.52%(n=3)。結果表明，3批薏苡仁油含酯量以薏苡仁油甘油三酯計，均不低于95%，符合規定。

2.2薏苡仁油的薄層色譜鑒別結果表明，供試品色譜中，在與亞油酸、甘油三油酸酯、薏苡仁油對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，且方法重復性好(圖1)。

2.3薏苡仁油中油酸與亞油酸的GC含量測定

2.3.1專屬性試驗油酸甲酯、亞油酸甲酯等色譜峰完全分離，分析時間<18 min(圖2)。

2.3.2定量限考察油酸甲酯定量限濃度為5.436 μg/mL，亞油酸甲酯定量限濃度為4.154 μg/mL。

2.3.3標準曲線的制備與線性關系考察結果測得油酸甲酯回歸方程為：

y=1.745 0 x-2.71×10-2，r=0.999 3

亞油酸甲酯回歸方程為：

y=2.677 6 x-8.60×10-3，r=0.999 5

結果表明，油酯甲酯在0.054 4～1.087 2 mg/mL范圍、亞油酸甲酯在0.041 5～1.030 8 mg/mL范圍呈良好的線性關系。

2.3.4精密度試驗A油酸甲酯/A水楊酸甲酯的RSD為0.36%，A亞油酸甲酯/A水楊酸甲酯的RSD為0.27%，表明符合精密度要求。

2.3.5穩定性試驗油酸RSD為0.52%，亞油酸RSD為0.69%，提示供試品溶液放置于4 ℃時在24 h內穩定。

2.3.6重復性試驗同一批薏苡仁油供試品油酸平均含量58.46%(RSD=1.05%，n=6)，亞油酸平均含量24.54%(RSD=2.12%，n=6)，說明含量測定方法重復性良好。

2.3.7加樣回收率試驗薏苡仁油中油酸與亞油酸的GC含量測定方法準確度良好，符合要求(表1)。

2.3.8樣品測定運用建立的薏苡仁油中油酸與亞油酸的GC含量測定方法，測定3批樣品中油酸與亞油酸含量，說明薏苡仁油中富含油酸、亞油酸(表2)。

表1　油酸甲酯和亞油酸甲酯回收率試驗結果

表2　薏苡仁油中油酸、亞油酸含量測定結果

3　討　論

在薄層色譜法分析中，實驗采用硅膠G為固定相，曾分別比較石油醚-乙醚-冰醋酸(9∶1∶0.1)及石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸(10∶3∶0.1)的展開系統，結果供試品斑點分離效果較差，產生明顯的拖尾；另外，曾采用聚酰胺薄膜為固定相，以石油醚-乙醚-冰醋酸(18∶2∶1)為展開劑，薄層展開后呈暗斑，難以檢視，且方法重復性較差。經試驗比較，結果選擇硅膠G薄層板，石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸(25∶5∶1)為展開劑的TLC鑒別方法，且能較好顯示薏苡仁油特征成分群。

在薏苡仁油的衍生化GC法分析中，曾先后比較采用非極性毛細管柱HP-5(30 m×0.32 mm×0.25 μm)和極性毛細管柱DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)對薏苡仁油中各脂肪酸組分的分離影響，結果非極性毛細管柱的分離效果較差，而極性毛細管柱DB-WAX在柱溫190 ℃下，可將薏苡仁油中各組分分離，故選擇極性毛細管柱DB-WAX對薏苡仁油中的油酸與亞油酸進行分析測定。同時，實驗篩選了內標物正十五烷、三十二烷、水楊酸甲酯。其中，正十五烷、三十二烷在極性毛細管柱上，出峰太快，甚至與溶劑峰混合，而水楊酸甲酯與薏苡仁油中的脂肪酸組分達到良好分離，且峰形尖銳，故選擇水楊酸甲酯作為內標物。

經薏苡仁油的GC分析提示，薏苡仁油中油酸、亞油酸為長碳鏈脂肪酸，沸點較高，難以直接采用GC法進行測定，故實驗通過衍生化處理，先將薏苡仁油中的油酸、亞油酸甲酯化，降低其沸點，采用甲酯化后的脂肪酸甲酯標準物作為對照品，再以GC法測定，內標法定量計算脂肪酸甲酯含量，由此換算得到薏苡仁油中油酸與亞油酸的含量，該方法準確度、靈敏度良好，18 min即可完成一個樣品的分析，為薏苡仁油的含量測定和質量控制提供了一個較為可行的分析方法。根據注射用薏苡仁油部頒標準(2001年版)測得薏苡仁油中油酸、亞油酸平均含量分別為51.65%及23.14%；運用本研究建立的GC內標法測得3批薏苡仁油中油酸、亞油酸平均含量分別為58.85%及24.75%，所得結果均符合注射用薏苡仁油部頒標準要求(油酸含量45%、亞油酸含量19%)規定。

[1]吳巖,原永芳.薏苡仁的化學成分和藥理活性研究進展[J].華西藥學雜志,2010,25(1)：111-113.

[2]胡少華,肖小年,易醒,等.薏苡仁的研究新進展[J].時珍國醫國藥,2009,20(5)：1059-1060.

[3]樂巍,邱蓉麗,吳德康,等.不同居群薏苡種仁脂肪酸成分的GC-MS分析[J].中藥材,2008,31(11)：1613-1614.

[4]鄭利,陳丹,范世明.不同產地薏苡仁的鑒別及含量測定[J].福建中醫藥大學學報,2012,22(5)：52,54.

[5]向智敏,祝明,陳碧蓮,等.HPLC-MS分析薏苡仁油中的甘油三酯成分[J].中國中藥雜志,2005,30(18)：1436-1438.

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[8]Pei P,Yan W,Zhu Y G,et al.Antitumor activity and immunomodulatory effects of the intraperitoneal administration of Kanglaite in vivo in Lewis lung carcinoma[J].J Ethnopharmacology,2012,143(2)：680-685.

[9]國家藥典委員會.國家藥品標準新藥轉正標準第30冊[S].北京：人民衛生出版社,2003：29.

(編輯:張慧茹)

Study on Quality Analysis of Coix Seed Oil

ZHENG Li,CHEN Dan,FAN Shiming,LIAO Shubin,HUANG Jiao,XIE Ping

Department of Pharmacy,Fujian University of TCM,Fuzhou 350122,China

ObjectiveTo study triglyceride content in the coix seed oil and to establish a qualitative and quantitative analysis method of coix seed oil.MethodsTitration was used to study triglyceride content in the coix seed oil.TLC was applied to identify the characteristic components in the coix seed oil.After derivatization,gas chromatography was used to determine the content of oleic acid and linoleic acid,through internal standard method with methyl salicylate as the internal standard substance.ResultsTotal esters content based on triglyceride content in the coix seed oil was not less than 95%.The qualitative identification with TLC was specific.Under the GC,methyl oleate had a good linearity in the range of 0.054 4～1.087 2 mg/mL,and the average recovery was 97.92% (RSD=1.24%,n=6).The methyl linoleate content was in the range of 0.041 5～1.050 8 mg/mL,while its average recovery was 100.4% (RSD=2.23%,n=6).In the 3 batches of coix seed oil,the content of oleic acid were 59.59%,58.29% and 58.67%; and the content of linoleic acid were 25.17%,24.31% and 24.77%.ConclusionThe established method for triglyceride content,TLC and GC are simple,accurate and reliable,which can be well used in quality control of coix seed oil.

coix；triglycerides；chromatography,gas；oleic acid；linoleic acid；quality control

2016-05-09

福建省科技計劃重點項目(2014Y0062)；福建省科技計劃項目(2010Y2004)

福建中醫藥大學 藥學院，福州350122

鄭利(1988-)，女，藥師，醫學碩士

陳丹.Email:13515026709@163.com

R194；R197；R273；R282.71；R73

A

1672-4194(2016)04-0222-05