5-氨基酮戊酸光動力作用對白念珠菌超微結(jié)構(gòu)的影響

張子平，鐘　熙，程　波，蘇惠春，陳麗紅

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5-氨基酮戊酸光動力作用對白念珠菌超微結(jié)構(gòu)的影響

張子平，鐘熙，程波，蘇惠春，陳麗紅

目的觀察5-氨基酮戊酸光動力對白念珠菌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，為研究5-氨基酮戊酸光動力抗菌的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。方法設(shè)置實(shí)驗組(5-氨基酮戊酸光動力作用后的白念珠菌組)及對照組，分別在透射電鏡下觀察2組菌株細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果透射電鏡下，5-氨基酮戊酸光動力作用后的白念珠菌細(xì)胞腫脹變形，細(xì)胞壁、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞壁疏松，細(xì)胞膜與細(xì)胞壁之間間隙大小不一，部分細(xì)胞可見細(xì)胞壁棉絮狀致密外層或細(xì)胞膜局灶性缺失的現(xiàn)象。結(jié)論5-氨基酮戊酸光動力對白念珠菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)具有一定的影響。

氨基酮戊酸；光化學(xué)療法；念珠菌，白色；顯微鏡檢查，電子，透射

白念珠菌是人體皮膚和黏膜上定居的正常菌群之一。作為常見的條件致病菌，它可以共生的方式定植于人體皮膚黏膜、胃腸道和泌尿生殖道等重要部位，在環(huán)境的多因素調(diào)控下，白念珠菌可改變其形態(tài)，由酵母相轉(zhuǎn)變成菌絲相。該特性在真菌的致病性上發(fā)揮著重要作用。目前，臨床上常用的抗白念珠菌藥物主要有4類：多烯類、唑類、丙烯胺類、棘白菌素類，但這些藥物都存在一定的毒副作用，且臨床上出現(xiàn)越來越多的耐藥株[1]。因此，尋找新的高效、安全的抗真菌方法成為亟需解決的問題。5-氨基酮戊酸誘導(dǎo)的光動力在皮膚科主要用于腫瘤及多種良性增生性皮膚病的治療，鑒于其高度選擇性及較低的毒副作用，且隨著真菌耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，研究者逐漸把目光投向真菌感染性疾病。目前，國外已有研究證實(shí)，光動力療法是一種通過使用光敏劑前體物質(zhì)來殺死多種念珠菌的潛在方法。相對于哺乳動物來說，細(xì)胞壁是真菌細(xì)胞所特有的結(jié)構(gòu)，是病原微生物抵御各種外界壓力(滲透、氧化應(yīng)激、紫外線等)的首個屏障[2]。它可激發(fā)和協(xié)調(diào)抵抗微生物的先天及后天性免疫應(yīng)答。筆者通過對5-氨基酮戊酸介導(dǎo)的光動力作用后的真菌細(xì)胞壁超微結(jié)構(gòu)的觀察，研究光動力療法是否會影響真菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，為新的抗真菌療法提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料菌株：白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC90028，由上海華山醫(yī)院皮膚科惠贈)。試劑：5-氨基酮戊酸(上海復(fù)旦張江生物有限公司)，YPD瓊脂培養(yǎng)基(2%葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母提取物，2%瓊脂)，YPD液體培養(yǎng)基(2%葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母提取物)，PBS液(實(shí)驗室配制)，DMEM培養(yǎng)基(上海賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)，3%戊二醛，1%鋨酸等。儀器：透射電子顯微鏡(EM208，荷蘭菲利浦公司)，倒置生物顯微鏡(BM-37BS，上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司)，超薄切片機(jī)(Leica UC-6型，德國萊卡公司)。

1.2方法

1.2.1白念珠菌菌懸液配制取冷凍真空干燥保存的白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC90028轉(zhuǎn)種于YPD瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。再從YPD瓊脂培養(yǎng)基上挑取單個菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中，置28 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h至對數(shù)生長期。1 500 r/min離心10 min，PBS洗滌2次。用含2.5%胎牛血清的DMEM重懸菌懸液。將菌液濃度調(diào)整為1.0×106～2.0×106cfu/mL。

1.2.25-氨基酮戊酸溶液配制將5-氨基酮戊酸用蒸餾水溶解并稀釋成1 mol/L的原液，再將原液用含2.5%胎牛血清的DMEM稀釋成100 mmol/L。

1.2.3白念珠菌菌懸液分組將1×106～2．0×106cfu/mL菌懸液接種于無菌96孔板中，分為實(shí)驗組和對照組。實(shí)驗組每孔100 μL 5-氨基酮戊酸溶液加100 μL菌懸液，對照組每孔加200 μL菌懸液，用錫紙包裹后，靜態(tài)孵育30 min。孵育后實(shí)驗組予光動力治療儀紅光照射(波長：635 nm，照光劑量為54.3 J，能量密度為96 mW/cm2，時間為3 min)，對照組不予紅光照射。照光后，2組均于37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，收集菌懸液。1 500 r/min，離心10 min，5 mL PBS洗滌2次。加入2 mL 10%胎牛血清離心，收集白念珠菌酵母細(xì)胞。

1.2.4透射電鏡制樣與觀察步驟標(biāo)本前固定：3%戊二醛-1．5%多聚甲醛-0.1 mmol/L PBS (pH 7.2) 4 ℃ 2 h以上；漂洗：0.1 mmol/L PBS (pH 7.2) 3次。標(biāo)本后固定：1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀4 ℃ 1．5 h；漂洗：0.1 mmol/L PBS(pH 7.2)3次；脫水：50%酒精10 min→70%酒精飽和醋酸鈾染液4 ℃過夜→90%酒精10 min→90%酒精-丙酮10 min→90%丙酮10 min→無水丙酮10 min 3次；浸透：無水丙酮+環(huán)氧樹脂618包埋劑(1∶1)1.5 h,純618包埋劑35 ℃ 3 h；包埋、聚合：35 ℃ 12 h，45 ℃ 12 h，60 ℃ 3 d；半薄切片，定位；切片、染色：超薄切片機(jī)切100 nm的超薄切片，經(jīng)醋酸鈾及檸檬酸鉛分別染色5～15 min，蒸餾水水洗，透射電鏡下觀察并攝片。

2　結(jié)　果

對照組：白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC90028酵母細(xì)胞呈圓形或橢圓形。細(xì)胞壁、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)連續(xù)完整，細(xì)胞壁全層厚約0.2～0.3 μm，位于細(xì)胞壁最外層的是纖維狀、棉絮狀的電子致密層結(jié)構(gòu)，厚約0.05～0.1 μm，其下是較厚的電子透明層，厚約0.1～0.15 μm(圖1)。實(shí)驗組：白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC90028酵母細(xì)胞經(jīng)5-氨基酮戊酸誘導(dǎo)的光動力處理后，細(xì)胞腫脹變形，細(xì)胞壁、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞壁破壞疏松，細(xì)胞膜與細(xì)胞壁之間間隙大小不一，其中位于細(xì)胞壁最外層的纖維狀、棉絮狀的電子致密層比未經(jīng)光動力處理的菌株變薄，部分細(xì)胞可見細(xì)胞壁棉絮狀致密外層或細(xì)胞膜局灶性缺失的現(xiàn)象(圖1)。

3　討　論

作為真菌和周圍環(huán)境的分界面，真菌細(xì)胞壁在維持自身形態(tài)和活性、介導(dǎo)菌體粘附于宿主細(xì)胞以及保護(hù)菌體免受外界損傷等方面發(fā)揮著重要的作用。它可激發(fā)和協(xié)調(diào)抵抗微生物的先天及后天性免疫應(yīng)答。參與構(gòu)成白念珠菌細(xì)胞壁的主要成分有：葡聚糖、幾丁質(zhì)以及甘露聚糖。其中，細(xì)胞壁中所占比重最大的成分為葡聚糖，它由β-1，3葡聚糖及β-1，6葡聚糖等交聯(lián)而成，約占細(xì)胞壁干質(zhì)量的50%～60%[3]。幾丁質(zhì)是一種β-1,4 N-乙酰氨基葡糖聚合物，呈線狀結(jié)構(gòu)，雖然在細(xì)胞壁中的含量很少(僅占細(xì)胞壁干質(zhì)量的1%～2%)，但其重要性卻不容忽視，它與β-1，3葡聚糖一起構(gòu)成了細(xì)胞壁剛性骨架結(jié)構(gòu)，在維持細(xì)胞形態(tài)和抵御外界壓力脅迫方面發(fā)揮了重要作用。2種聚合物共同協(xié)調(diào)和調(diào)控細(xì)胞在不同環(huán)境下的應(yīng)答反應(yīng)。藥物和壓力導(dǎo)致其中一種聚合物的數(shù)量改變后，可立即啟動增加另外一種聚合物數(shù)量的機(jī)制以提供必要的強(qiáng)度來維持細(xì)胞的完整性[4]。甘露聚糖的成分是甘露糖蛋白，約占細(xì)胞壁干質(zhì)量的35%～60%。研究者在透射電鏡下觀察細(xì)胞壁不同組分的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)部分幾丁質(zhì)和β-1，3葡聚糖絞索聯(lián)系構(gòu)成細(xì)胞壁電子透明內(nèi)層結(jié)構(gòu)，而位于細(xì)胞壁最外層的甘露糖蛋白也稱做細(xì)胞壁蛋白(cell wall protein,CWP)，在透射電鏡下呈現(xiàn)出纖維狀、棉絮狀的結(jié)構(gòu)，CWP決定了細(xì)胞壁的孔隙性，其含量隨著真菌活性的不同而改變，甘露糖蛋白在對宿主細(xì)胞識別、粘附以及激發(fā)宿主的免疫應(yīng)答過程中均發(fā)揮重要的作用[4]。

光動力療法是一種聯(lián)合應(yīng)用光敏劑及相應(yīng)光源通過光動力學(xué)反應(yīng)選擇性破壞靶組織的一種非侵襲性的全新治療技術(shù)[5]。光動力反應(yīng)的基本過程為靶細(xì)胞通過攝取外源性光敏劑或光敏劑前體進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)內(nèi)源性途徑產(chǎn)生光敏分子，光敏分子受到相應(yīng)波長的光照射，吸收光子能量后由基態(tài)躍遷至不穩(wěn)定的三重態(tài)，然后迅速經(jīng)過物理或化學(xué)退激過程釋放能量而返回至基態(tài)。物理退激過程可產(chǎn)生熒光，可通過分析熒光光譜對疾病進(jìn)行診斷；化學(xué)退激過程中，處于三重態(tài)的光敏分子經(jīng)2種光動力反應(yīng)機(jī)制分別將電子和能量傳遞給周圍的生物分子：Ⅰ類光動力反應(yīng)，與周圍的物質(zhì)作用，產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的自由基；Ⅱ類光動力反應(yīng)，與氧分子作用產(chǎn)生單態(tài)氧，這些活性氧簇能與多種生物大分子發(fā)生相互作用，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從而導(dǎo)致細(xì)胞受損甚至死亡，達(dá)到治療作用[6]。細(xì)胞內(nèi)多種細(xì)胞器可成為單態(tài)氧導(dǎo)致的光動力氧化作用的靶器官。其中包括失活的酶、其他蛋白質(zhì)類和過氧化脂質(zhì)類，最終引起細(xì)胞膜、溶酶體、線粒體的裂解[7]。可見由激活的光敏劑產(chǎn)生的單態(tài)氧是一種非特異性氧化劑，且細(xì)胞對其不存在防御作用[8]。抗氧化酶如過氧化物酶、過氧化氫酶可抵御某些反應(yīng)活性氧(reactive oxygen species,ROS)，但是不能抵御單態(tài)氧，單態(tài)氧甚至可使抗氧化酶失活，如過氧化氫酶和超氧化物歧化酶[7]。

光敏劑5-氨基酮戊酸被細(xì)胞攝取后，經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)，最后在線粒體內(nèi)生成光敏物質(zhì)原卟啉Ⅸ，后者經(jīng)光照后產(chǎn)生的ROS對細(xì)胞器產(chǎn)生非特異性光動力損傷作用，引起細(xì)胞膜、溶酶體、線粒體等的裂解。通過實(shí)驗，筆者發(fā)現(xiàn)，經(jīng)光動力處理后的白念珠菌的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。在透射掃描電鏡下，可看到白念珠菌的細(xì)胞壁被破壞，結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞膜與細(xì)胞壁之間間隙大小不一，特別是“電子透明層”變得不均勻、厚薄不一，提示光動力對幾丁質(zhì)和β-1，3葡聚糖有明顯損傷作用。由此推測，幾丁質(zhì)和β-1，3葡聚糖在光動力作用后，數(shù)量大幅減少，維持細(xì)胞壁完整性的剛性骨架被破壞，細(xì)胞壁變得疏松、不完整。本實(shí)驗也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)光動力作用后，菌株的細(xì)胞壁最外層的纖維狀、棉絮狀的電子致密層比對照組菌株變薄，部分細(xì)胞可見細(xì)胞壁棉絮狀致密外層局灶性缺失的現(xiàn)象，推測光動力同時破壞了甘露糖蛋白。Monfrecola等的研究結(jié)果顯示，白念珠菌經(jīng)5-氨基酮戊酸誘導(dǎo)的光動力處理后，細(xì)胞膜被破壞，細(xì)胞壁腫脹，部分甚至缺如[9]。本實(shí)驗也顯示，菌株的細(xì)胞膜部分或完全缺失，呈溶解狀，與上述研究結(jié)果類似。二者的差異性考慮是由實(shí)驗條件及參數(shù)設(shè)置不同造成的，但大體上的改變是相符的。以上改變對細(xì)胞的活性、繁殖及毒力的影響具體有多大，目前還不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。但是，5-氨基酮戊酸誘導(dǎo)的光動力有望通過特異性改變真菌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)而影響其活性，從而降低其致病力，而對人類宿主細(xì)胞又幾乎不具有毒副作用。據(jù)此光動力療法有望成為一種新的有效、低毒的抗真菌療法。

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(編輯：何佳鳳)

Influence of 5-aminolevulinic Acid Photodynamic on Ultrastructure of Candida Albicans

ZHANG Ziping,ZHONG Xi,CHENG Bo,SU Huichun,CHEN Lihong

Institute of Dermatology,The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China

ObjectiveTo observe the influence of 5-aminolevulinic acid photodynamic on ultrastructure of Candida albicans and to provide a theoretical basis forstudyingantifungal mechanism of ALA-PDT.MethodsUltrastructure of Candida albicans in experimental group(subjected to 5-aminolevulinic acid photodynamic)and in control group were observed under transmission electron microscope.ResultsUnder transmission electron microscope,the cells,after being subjected to 5-aminolevulinic acid photodynamic,presentedswelling deformation,showing incomplete walland membrane structure.The cell wall was loose,and the gap between the cell membrane and cell wall varied in sizes.We also observed,in some cells,incomplete cell wall structure with electron dense layers and cell membrane discontinuation at localized area.Conclusions5-aminolevulinic acid photodynamic may play a role in the structure of cell wall of Candida albicans.

aminolevulinic acid; photochemotherapy; Candida albicans; microscopy,electron,transmission

2016-03-30

福建省中青年教師教育科研項目(JB13394)

福建醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院皮膚科，福州350005

張子平(1962-)，男，主任醫(yī)師.Email:2558080320@qq.com

R379.4；R453；R739.5；R75；R916.4；R977.4

A

1672-4194(2016)04-0260-04