乙?；⒐艿鞍爪猎诜?、肝和腎纖維化中的表達及其病理意義

耿玉聰，高學敏，李世峰，徐丁潔，徐　洪，楊　方

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乙酰化微管蛋白α在肺、肝和腎纖維化中的表達及其病理意義

耿玉聰1，高學敏1，李世峰1，徐丁潔2，徐洪1，楊方1

目的研究乙?；⒐艿鞍爪?Ac-α-Tub)在動式染塵矽肺大鼠肺纖維化模型、單側輸尿管結扎(UUO)腎纖維化模型和硫代乙酰胺(TAA)致肝纖維化模型中的表達及其病理意義。方法采用動式染塵構建矽肺大鼠模型，采用UUO構建腎纖維化模型，采用TAA構建肝纖維化模型。采用免疫組織化學染色觀察Ac-α-Tub及波形蛋白(vimentin)在組織中的差異表達，采用HistoQurst圖像分析軟件對免疫組織化學結果進行分析。結果隨著染塵時間的延長，vimentin的陽性表達率明顯上調，而Ac-α-Tub的陽性表達率明顯下調；在肝、腎纖維化中，隨著造模時間的延長，vimentin和Ac-α-Tub的陽性表達率均明顯上調。結論Ac-α-Tub在肺、肝和腎纖維化中陽性細胞的定位及臨床病理意義均具有差異，其缺失表達可能提示肺纖維化進展，而在肝、腎纖維化過程中則可能起到相反作用。

微管蛋白；乙?；饔茫焕w維化；免疫組織化學；染色與標記

細胞骨架蛋白(包括微管、微絲和中間絲)在維持細胞的形態、調控其可塑性以及細胞的粘附、遷移、物資運輸和增殖方面發揮了重要的調節作用。本課題組前期研究發現，乙酰化微管蛋白(acetylated α-tubulin,Ac-α-Tub)、微絲蛋白α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和中間絲蛋白波形蛋白(vimentin)在矽肺大鼠模型中差異表達，其中α-SMA是公認的肌成纖維細胞標記物，vimentin在肺組織中主要標記了活化的巨噬細胞，二者是矽肺大鼠纖維化較為明確的標記物，反映了矽肺大鼠纖維化的病變程度；而作為支氣管纖毛上皮細胞標記物的Ac-α-Tub，可在正常肺泡壁的多種細胞(肺泡上皮細胞、成纖維細胞和內皮細胞)中陽性表達，而在矽結節及間質纖維化區域缺失表達，可能是矽肺纖維化另一個新的標記物[1-2]。然而，Ac-α-Tub在其他纖維化模型中是否也具有類似的表達特點，目前仍未所知。因此，本實驗以Ac-α-Tub作為研究靶向，采用免疫組織化學染色方法檢測其在動式染塵構建的矽肺大鼠模型、單側輸尿管結扎(unilateral ureteral occlusion,UUO)構建的腎纖維化模型和硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)構建的肝纖維化模型中的差異表達，采用HistoQurst圖像分析軟件進行圖像分析并探討其病理學特點，現報道如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物成年清潔級雄性Wistar大鼠72只，體質量(180±10)g(170～190 g)[北京維通利華實驗動物技術有限公司(許可證號：SCXK京2009-0003]，飼養于華北理工大學動物實驗中心屏障實驗室(許可證號：SYXK冀2010-0038)，自由飲食進水。

1.1.2試劑TAA(美國Sigma公司)；伊紅染液(BA4041)、蘇木精(BA4024，珠海BASO生物技術有限公司)；Ac-α-Tub鼠抗(sc-23950，美國Santa Cruz公司)；vimentin兔抗(Ab92547，美國Abcam公司)；通用型免疫組織化學試劑盒(PV-6000)及DAB顯色試劑盒(ZLI-9032,北京中杉金橋)。

1.2方法

1.2.1構建矽肺纖維化模型采用動式染塵控制系統(HPOE-ED8050)構建矽肺纖維化模型，在溫度20～25 ℃、濕度70%～75%、柜內壓力-50～+50 Pa、氧含量20%、SiO2流速3.0～3.5 mL/min、SiO2濃度2 000 mg/m3的條件下染塵，3 h/d，分別于4，8和16周處理(每組n=6)。對照組(n=6)未做處理。

1.2.2構建腎纖維化模型大鼠麻醉后，分離左側輸尿管，用4-0慕絲線雙結扎輸尿管的近膀胱端，雙結扎中間離斷輸尿管以防逆行性感染，肌肉、皮膚縫合。于1，2，3周處理(每組n=6)。對照組(n=6)暴露左側輸尿管后不結扎，之后縫合[3]。

1.2.3構建肝纖維化模型腹腔注射TAA(每次200 mg/kg)，每周3次，持續1，3，6周處理(每組n=6)。對照組(n=6)腹腔注射生理鹽水，劑量及時間同模型組。

1.2.4免疫組織化學檢測Ac-α-Tub、vimentin的表達石蠟切片常規脫蠟至水，高壓修復，H2O2去除內源性過氧化物酶，一抗(1∶200)4 ℃過夜，二抗37 ℃ 20 min，DAB顯色，蘇木精輕度復染，中性樹膠封片。采用HistoQuest全景組織細胞定量分析系統(奧地利TissueGnostics公司)分析圖像。首先進行全景組織掃描(×200)，隨機選取5個視野(1 mm2)進行蘇木精和DAB染色拆分，依據軟件的回溯功能，設定陽性細胞參數(包括蘇木精染色平均強度、DAB染色平均強度、染色面積、形狀比斜率等)，自動分析后獲得陽性細胞百分比[4]。由于Ac-α-Tub在肺組織支氣管纖毛上皮、腎小球區域恒定表達，因此在分析時需去除該區域。

2　結　果

2.1Ac-α-Tub在動式染塵肺纖維化模型中的差異表達H-E染色結果顯示，染塵4周偶見細胞性矽結節的形成，染塵8周可見多個孤立的細胞性矽結節，而染塵16周見多個細胞性矽結節的融合，可見細胞纖維性矽結節的形成。與原有支氣管灌注SiO2構建的大鼠矽肺模型一致，Ac-α-Tub可強陽性表達于支氣管纖毛上皮細胞，在正常肺泡組織中的多種細胞成分(肺泡上皮細胞、成纖維細胞和內皮細胞)中均有陽性表達，而在矽結節及間質纖維化區域中缺失表達(圖1)。vimentin可表達于間質的成纖維細胞，且強陽性表達于巨噬細胞。圖像分析結果顯示，在對照組及染塵4，8，16周組中，Ac-α-Tub陽性細胞百分比逐漸增高，其中染塵8，16周組與對照組比較，差別均具有統計學意義(P<0.05，表1)。而vimentin陽性細胞百分比隨著染塵時間的延長而增高，染塵各時間組與對照組比較，差別均具有統計學意義(P<0.05)。

表1　Ac-α-Tub、vimentin在大鼠矽肺模型中的陽性細胞表達Tab 1　The positive expression rate of Ac-α-Tub and vimentin in silicotic rats　%

n=6.Ac-α-Tub:乙酰化微管蛋白；vimentin：波形蛋白.與對照組比較，☆：P<0.05.

2.2Ac-α-Tub在UUO大鼠腎纖維化模型中的差異表達H-E染色結果顯示，對照組無明顯病理改變，而UUO 1周組腎小球結構基本正常，腎小管擴張，腎間質略增寬，間質出現較多炎細胞浸潤；2，3周組可見腎小囊增寬，梗阻區域腎小管萎縮，多見腎間質細胞增殖，部分腎小球萎縮。免疫組織化學染色結果顯示，Ac-α-Tub可陽性表達于腎小球，同時在部分腎小管上皮細胞中陽性表達，隨著造模時間延長，其在梗阻/纖維化區域的腎小管上皮細胞陽性表達，且陽性表達率逐漸上調，UUO 1，2，3周組與對照組比較，差別均具有統計學意義(P<0.05，圖2)。而vimentin在對照組僅表達于腎小球系膜細胞，偶見腎小管間質細胞陽性表達；在UUO組中的間質纖維化區域和腎小管上皮細胞中均有明顯的陽性表達，且隨病變程度的加重而增加，UUO 1，2，3周組與對照組比較，差別均具有統計學意義(P<0.05，表2)。

表2Ac-α-Tub、vimentin在UUO模型中的陽性細胞表達

Tab 2The positive expression rate of Ac-α-Tub and vimentin in UUO rats%

n=6.Ac-α-Tub:乙?；⒐艿鞍?；vimentin：波形蛋白; UUO:單側輸尿管結扎.與對照組比較，☆：P<0.05.

2.3Ac-α-Tub在TAA大鼠肝纖維化模型中的差異表達H-E染色結果顯示，對照組無明顯改變。TAA染毒1周可見大量肝細胞空泡樣變性、壞死；3周可見門管區及其周圍組織星芒狀纖維化；6周可見纖維化間隔形成，肝小葉結構凌亂，可見假小葉形成。在對照組中偶見Ac-α-Tub陽性表達的肝星狀細胞，隨著染毒時間增加，Ac-α-Tub陽性表達的星狀細胞數目增多，多集中于纖維化區域，其在對照組及TAA 1，3和6周組中的陽性表達率逐漸增高(圖3，表3)，TAA 1，3，6周組與對照組比較，差別均具有統計學意義(均為P<0.01)。vimentin亦可陽性標記肝星狀細胞，隨著染毒時間延長，能夠較為明確的標記纖維化區域，陽性表達率隨造模時間延長而逐漸增多，TAA 1，3，6周組與對照組比較，差別具有統計學意義(均為P<0.01)。

表3Ac-α-Tub、vimentin在TAA模型中的陽性細胞表達

Tab 3The positive expression rate of Ac-α-Tub and vimentin in TAA rats%

n=6.Ac-α-Tub:乙?；⒐艿鞍祝籿imentin：波形蛋白；TAA：硫代乙酰胺.與對照組比較，☆：P<0.05.

3　討　論

微管蛋白作為細胞骨架蛋白的重要組成部分，在穩定細胞形態、可塑性，參與調控細胞遷移、粘附、分裂、細胞內的物質運輸及信號的傳遞等方面發揮著重要的調控作用。微管蛋白的氨基酸序列和微管結構在進化上高度保守，其功能的多樣性主要取決于翻譯后修飾作用，其中乙?；揎棇τ诰S持微管蛋白聚合的穩定具有重要意義。研究證明，Ac-α-Tub主要表達于具有纖毛上皮、鞭毛和軸突的組織或細胞中，在肺組織中可以作為支氣管纖毛上皮細胞的標記物[5]。本課題組前期研究也發現，Ac-α-Tub主要強表達于腦組織，在食管、胃和大腸組織中多標記于神經細胞，在脾臟中可陽性表達于單核細胞，在主動脈、心臟和骨骼肌中不表達，而在矽肺大鼠模型(支氣管灌注SiO2)中缺失表達，體外研究也顯示，血管緊張素(angiotensin,Ang)Ⅱ誘導的肌成纖維細胞伴隨Ac-α-Tub的表達下調[2]。在本研究中，采用動式染塵構建矽肺大鼠模型，能夠出現“細胞性矽結節-細胞纖維性矽結節-纖維細胞性矽結節”逐漸進展的病理學特征。與本課題組以往研究一致，Ac-α-Tub在矽結節內及間質纖維化區域中缺失表達，相反vimenitn則在此區域內陽性高表達，提示Ac-α-Tub的缺失表達在矽肺大鼠模型中能夠作為一個反映纖維化進展的指標。本研究結果顯示，在肝、腎纖維化模型中，Ac-α-Tub所反映的差異表達與肺纖維化模型不同。在腎組織中，Ac-α-Tub常被用作初級纖毛的標記物，在腎組織缺血4 h和缺血后1 d內，Ac-α-Tub標記的初級纖毛長度縮短，而在缺血后8 d內逐漸升高，至16 d恢復至正常長度，且體外實驗顯示，處于增殖期的細胞初級纖毛長度短、成熟的細胞較分化狀態的細胞長度短[6-7]。而在單腎切除模型中，由于尿液流體剪切力的增加，能夠誘導近曲小管粘附連接蛋白E-鈣黏蛋白、緊密連接蛋白ZO-1表達的下調，同時伴有初級纖毛的缺失[8]。體外研究也顯示，腎小管上皮細胞初級纖毛的縮短與抵抗自噬有關[9]。本研究中，Ac-α-Tub在對照組中陽性表達于腎小球細胞和遠曲小管上皮細胞，而在UUO模型中還可表達于近曲小管上皮細胞，隨病變程度增加而陽性表達增加，推測可能是梗阻性病變引起的一種適應性反應。本研究還發現，Ac-α-Tub可陽性表達于肝星狀細胞，隨著TAA肝纖維化模型的進展而陽性表達率明顯上調。在酒精性肝病大鼠模型和體外肝細胞予以乙醇刺激，均能夠顯著誘導Ac-α-Tub表達的上調，推測可能是肝細胞對乙醇的一種應激性反應[10]。

體外研究顯示，在轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)β1誘導的肺泡Ⅱ型上皮A549細胞及人肺成纖維細胞、Ang Ⅱ誘導的內皮細胞遷移實驗中，均發現α-Ac-Tub表達下調，與上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、肌成纖維細胞分化和內皮屏障功能障礙密切相關[11-13]。而在正常大鼠腎成纖維細胞中，TGF-β1能夠促進微管蛋白mRNA水平表達的上調[14],提示α-Ac-Tub在纖維化疾病中的作用差異可能與組織特異性有關。同時，乙酰化是微管蛋白翻譯后修飾動態的一種動態調控機制，而Ac-α-Tub是微管蛋白乙酰化的產物，參與了微管蛋白的聚合/解聚以形成細胞骨架或特定的細胞器(如纖毛、鞭毛、軸突等)，這是3個不同層次的概念，在纖維化疾病發生、發展中的具體作用機制仍需進一步研究探討。本研究發現了Ac-α-Tub表達的組織特異性，且在不同器官的纖維化病變中，細胞定位和病理意義并不相同，其在肺纖維化中的缺失表達，在肝、腎纖維化中的高表達，值得進一步研究探討。

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(編輯：何佳鳳)

The Expression and Pathological Significances of Ac-α-Tub in Lung,Liver and Renal Fibrosis

GENG Yucong1,GAO Xuemin1,LI Shifeng1,XU Dingjie2,XU Hong1,YANG Fang1

1.Medical Research Center; 2.College of Chinese Traditional Medicine,North China University of Science and Technology,Tangshan 063000,China

ObjectiveTo observe the expression and pathological significance of acetylated α-tubulin (Ac-α-Tub) in rats with silicosis,unilateral ureteral obstruction (UUO) and thioacetamide (TAA).MethodsSilicosis model was established with inhalation of d SiO2in a dynamic manner.Renal fibrosis model was established by UUO.Hepatic fibrosis model was established by TAA intraperitoneal injection.The expression of Ac-α-Tub and vimentin were measured by immunohistochemistry staining and analyzed by HistoQurst software.ResultsWith the time of dust exposure extended,the positive rate of vimentin was increased accompanyinga down-regulation of Ac-α-Tub.In the renal and hepatic fibrosis,the positive rate of Ac-α-Tub and vimentin was all increased with the extension of the time of models creation.ConclusionThere is a differential expression of Ac-α-Tub and pathological significance in lung,renal and hepatic fibrosis.The down-expression of Ac-α-Tub in silicosis,and up-expression of it in UUO and TAA in rats.

tubulin; acetylation; fibrosis; immunohistochemistry; staining and labeling

2016-04-16

國家自然科學基金(81472953)；河北省自然科學基金(H201409115)；河北省研究生創新項目(2015S04)

華北理工大學，唐山 0630001.醫學實驗研究中心；2.醫學中醫學院

耿玉聰(1989-)，女，華北理工大學2015級碩士研究生

楊方.Email:fangyang1955@163.com

R135.2；R693.2；R575.3；R977.6

A

1672-4194(2016)04-0232-05