鉤吻素子對(duì)小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用

楊　漸，蔡宏達(dá)，陳澤鴻，方夢寒，俞昌喜

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鉤吻素子對(duì)小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用

楊漸1，蔡宏達(dá)2，陳澤鴻1，方夢寒1，俞昌喜1

目的觀察鉤吻素子對(duì)小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用。方法篩選成功建立佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的小鼠，隨機(jī)分為模型組、鉤吻素子高(20 mg/kg)、中(4 mg/kg)、低(0.8 mg/kg)劑量及陽性對(duì)照藥吲哚美辛處理組(10 mg/kg)，每組12只，另設(shè)置12只未免疫正常小鼠為對(duì)照組。建模后第8天起，以灌胃方式給藥，每天1次，連續(xù)10 d。以小鼠體質(zhì)量、注射足厚度、熱輻射痛閾熱縮足反射潛伏期(PWTL)以及組織病理學(xué)變化等為指標(biāo)，觀察鉤吻素子的治療作用。結(jié)果小鼠建模后出現(xiàn)顯著的體質(zhì)量減輕、注射足厚度增加、熱輻射痛閾下降，蘇木精-伊紅(H-E)染色顯示關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞、滑膜增生以及炎癥細(xì)胞浸潤。鉤吻素子灌胃后，小鼠體質(zhì)量增加，顯著高于模型組，注射足厚度顯著小于模型組，PWTL顯著高于模型組，作用呈劑量依賴性。H-E染色顯示鉤吻素子處理組小鼠踝關(guān)節(jié)的炎性細(xì)胞浸潤及滑膜增生、骨質(zhì)破壞等得到改善。結(jié)論鉤吻素子對(duì)小鼠的佐劑性關(guān)節(jié)炎具有治療作用。

鉤吻；鉤吻堿；吲哚生物堿類；關(guān)節(jié)炎，實(shí)驗(yàn)性；關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；小鼠

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種病因未明的慢性、以炎性滑膜病變?yōu)橹鞯淖陨砻庖咝约膊。饕Y狀包括關(guān)節(jié)僵硬、紅腫、疼痛及畸形，可伴有體質(zhì)量減輕、低熱、疲乏等，具有很高的致殘率[1]。臨床上常用的抗RA藥物療效相對(duì)有限，不良反應(yīng)較多。雖然近年來不斷涌現(xiàn)的生物制劑對(duì)RA的治療效果有明顯的提高，但也存在價(jià)格昂貴、易降解、引發(fā)嚴(yán)重感染和腫瘤風(fēng)險(xiǎn)等缺點(diǎn)，因此新型抗RA藥物仍有待于研發(fā)[2-4]。

我國中草藥資源豐富，在中草藥中尋找具有治療RA功效的藥用活性物質(zhì)是發(fā)現(xiàn)新型抗RA藥物的一個(gè)重要途徑。鉤吻素子是馬錢科植物鉤吻(Gelsemium elegans Benth.)所含吲哚類生物堿中含量最高且毒性相對(duì)較小的一種有效成分[5]，具有調(diào)節(jié)免疫及抗炎鎮(zhèn)痛等效應(yīng)[6-7]，但其是否可用于RA的治療尚不明確。為探討鉤吻素子對(duì)RA是否具有治療作用，本研究選用一種較為常用的RA動(dòng)物模型，即佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis,AA)模型[8]，觀察鉤吻素子對(duì)RA的治療作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物雄性昆明種小鼠，體質(zhì)量18～23 g[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2009-0005]。光暗周期12/12 h下恒溫(23±2)℃、恒濕(50±5)%環(huán)境飼養(yǎng)，自由飲水，每次給藥前12 h禁食。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均遵守國際與本地實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和保護(hù)委員會(huì)頒布的相關(guān)條例。

1.1.2試劑鉤吻素子粉劑由福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院神經(jīng)藥理課題組提供，超高效液相測定純度99%(圖1)，鹽酸溶解后以氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7.0，而后以生理鹽水定容并配制為終濃度分別為0.08,0.4及2 mg/mL的溶液；吲哚美辛片劑(25 mg/片，上海九福藥業(yè))；完全弗氏佐劑(美國Sigma公司)；卡介苗凍干粉劑(上海生物制品公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1建立小鼠AA模型參照文獻(xiàn)[9]方法，將卡介苗置于80 ℃恒溫水浴1 h后與完全弗氏佐劑充分乳化(終濃度為5 mg/mL)，以微量注射器注射于小鼠右側(cè)足底(20 μL/只)建立AA小鼠模型。以體質(zhì)量變化為指標(biāo)觀察小鼠全身反應(yīng)，足厚度為指標(biāo)觀察模型鼠后足腫脹，熱刺激縮足潛伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL)為指標(biāo)觀察模型鼠后足疼痛，并以蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,H-E)染色法觀察模型鼠注射足關(guān)節(jié)的病理變化。

1.2.2測定小鼠足跖厚度為觀察模型鼠后足腫脹情況，參照文獻(xiàn)[9]，使用游標(biāo)卡尺測量小鼠后足跖部厚度，每次測量3次，取平均值。

1.2.3測定小鼠后足熱輻射痛閾為觀察模型鼠后足疼痛情況，以熱刺激痛儀(PL-200型；成都泰盟科技有限公司)測定其PWTL，測定時(shí)維持環(huán)境室溫(22±1)℃，濕度(55±10)%，調(diào)節(jié)儀器發(fā)熱功率至23 W并預(yù)熱30 min，將動(dòng)物置于測試籠中適應(yīng)至其安靜后，將刺激光源對(duì)準(zhǔn)模型鼠注射足底中部，從開始照射至小鼠出現(xiàn)抬腿回避的時(shí)間即為PWTL。給藥期間測定時(shí)間為給藥后30 min，設(shè)置切斷時(shí)間為30 s以防止組織損傷，每只動(dòng)物測定3次，每次間隔6～8 min，結(jié)果取其平均值。

1.2.4H-E染色小鼠處死后立即剪取踝關(guān)節(jié)，以4%多聚甲醛溶液固定后，用10%的乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)溶液脫鈣20 d，每周更換EDTA溶液1次；脫鈣后以干凈雙蒸水浸洗標(biāo)本2～3 h，每10 min換液1次，而后行石蠟包埋與切片(厚度5 μm)，H-E染色；于光學(xué)顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)滑膜增生，炎性細(xì)胞浸潤以及軟骨骨質(zhì)破壞及關(guān)節(jié)周圍組織水腫等病理學(xué)變化。

1.2.5分組及建模以非甾體類藥物吲哚美辛為陽性對(duì)照藥，在小鼠AA模型上觀察鉤吻素子的治療作用。小鼠于建模前1天測定基礎(chǔ)痛閾，PWTL<8 s者予以剔除。按照上述方法建立AA模型，模型建立成功標(biāo)準(zhǔn)為注射后第8天注射足厚度增加>0.5 mm且PWTL<8 s。選擇造模成功的小鼠隨機(jī)分為5組，每組12只。依次為模型組、鉤吻素子高劑量(20 mg/kg)處理組、鉤吻素子中劑量(4 mg/kg)處理組、鉤吻素子低劑量(0.8 mg/kg)處理組以及吲哚美辛處理組(10 mg/kg)；另有未免疫正常小鼠12只設(shè)置為對(duì)照組。致炎后第8天開始按0.1 mL/10 g體積灌胃給藥，每天1次，連續(xù)10 d，對(duì)照組與模型組小鼠均按相同體積給予生理鹽水。于建模后第4,8,12,16,18天分別測定小鼠體質(zhì)量、足厚度及PWTL，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，取踝關(guān)節(jié)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

2　結(jié)　果

2.1小鼠AA模型的建立本研究共使用基礎(chǔ)痛閾合格的小鼠100只，致炎后第2天起即出現(xiàn)后足紅腫及PWTL的下降，但部分小鼠的炎癥發(fā)展具有自限性，按照1.2.5所述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，建模成功率為67%。

2.2鉤吻素子對(duì)AA小鼠體質(zhì)量變化的影響建模前各組小鼠體質(zhì)量無差異，建模后模型組小鼠出現(xiàn)活動(dòng)減弱，食量減少，體質(zhì)量增長緩慢，而后出現(xiàn)體質(zhì)量減輕，建模后第8,12,16及18天均顯著低于對(duì)照組小鼠(P<0.01)。鉤吻素子可呈劑量依賴性抑制模型鼠體質(zhì)量的減輕，鉤吻素子高劑量處理組建模后第12天起、中劑量處理組第16天起小鼠體質(zhì)量顯著高于模型組小鼠(P<0.01或0.05)，并出現(xiàn)體質(zhì)量增加，吲哚美辛亦可顯著抑制模型小鼠體質(zhì)量的減輕(圖2)。

2.3鉤吻素子對(duì)AA小鼠后足腫脹的抑制作用建模前各組小鼠注射足厚度無顯著性差異，建模后第4天起模型組小鼠注射足即出現(xiàn)明顯的炎癥腫脹，其厚度顯著大于對(duì)照組(P<0.01)，并呈進(jìn)行性加重。鉤吻素子可顯著抑制模型鼠注射足炎癥腫脹，作用呈劑量依賴性，建模后第12天起鉤吻素子高、中、低劑量處理組足厚度均顯著小于模型組(P<0.01或0.05)。吲哚美辛對(duì)模型鼠的足腫脹亦有顯著的抑制作用(圖3)。

2.4鉤吻素子對(duì)AA小鼠注射足熱痛敏的緩解作用建模前各組小鼠熱輻射痛閾無顯著性差異，建模后第4天起模型組小鼠即出現(xiàn)注射足PWTL的顯著縮短(P<0.01)，提示注射足出現(xiàn)熱痛敏，并持續(xù)2周以上。鉤吻素子灌胃可升高模型鼠注射足PWTL，作用呈劑量依賴性，建模后第12天起，鉤吻素子處理組小鼠注射足PWTL顯著高于模型組(P<0.01或0.05)，提示鉤吻素子對(duì)模型鼠注射足熱痛敏具有緩解作用。吲哚美辛亦體現(xiàn)出對(duì)模型鼠注射足熱痛敏的緩解作用(圖4)。

2.5鉤吻素子對(duì)AA小鼠踝關(guān)節(jié)組織病理改變的影響H-E染色顯示，正常組小鼠踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)(箭頭所示，下同)清晰，滑膜組織正常，未見增生及炎性細(xì)胞浸潤(圖5A)；模型組小鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中有大量炎性細(xì)胞浸潤，滑膜組織明顯增生，排列紊亂，關(guān)節(jié)間隙變窄，部分關(guān)節(jié)軟骨破壞(圖5B)；低劑量鉤吻素子處理組小鼠對(duì)關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變無明顯改善作用，關(guān)節(jié)間隙仍不清晰，可見炎癥細(xì)胞浸潤(圖5D)；吲哚美辛組(圖5C)及鉤吻素子中劑量(圖5E)、高劑量(圖5F)處理組小鼠踝關(guān)節(jié)病變較模型組有明顯減輕，關(guān)節(jié)間隙雖仍有輕度狹窄但結(jié)構(gòu)較為清晰，炎性細(xì)胞浸潤與滑膜增生情況均有改善。

3　討　論

AA又稱為弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎，是由Pearson等于20世紀(jì)50年代創(chuàng)立的一種免疫性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，在臨床表現(xiàn)、病理學(xué)改變及發(fā)病機(jī)制等方面與人類RA有許多相似之處，發(fā)展至今已成為篩選研究治療RA藥物較為理想的動(dòng)物模型之一[11-12]。本研究在昆明鼠足底注射弗氏佐劑，以足厚度觀察注射足腫脹程度，以PWTL觀察關(guān)節(jié)疼痛，以體質(zhì)量的變化觀察模型小鼠全身情況，并通過H-E染色觀察小鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AA模型小鼠出現(xiàn)了RA樣的炎癥病變，表現(xiàn)為以注射足踝關(guān)節(jié)為主的炎癥性紅、腫、痛等，與對(duì)照組比較，出現(xiàn)了顯著的注射足腫脹與熱痛敏，組織病理學(xué)檢查有關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞及炎癥細(xì)胞浸潤，并有體質(zhì)量減輕的全身表現(xiàn)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[9,13]，提示已成功建立AA小鼠模型。

與模型組比較，AA小鼠鉤吻素子處理組小鼠注射足厚度減小，熱輻射痛閾升高，提示模型小鼠的足腫脹及熱痛敏得以緩解，這些作用呈劑量依賴性，提示鉤吻素子對(duì)AA小鼠模型體現(xiàn)抗炎與鎮(zhèn)痛的作用，連續(xù)給藥后模型小鼠后足炎癥的進(jìn)展被抑制。病理檢查提示，鉤吻素子(4，20 mg/kg)處理組AA小鼠后足踝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞及炎癥細(xì)胞的浸潤也有一定程度減輕。此外，體質(zhì)量改變也是評(píng)價(jià)AA疾病進(jìn)程和對(duì)抗炎藥物治療反應(yīng)的一個(gè)指標(biāo)。鉤吻素子能夠抑制模型鼠的體質(zhì)量減輕，提示其對(duì)模型的全身反應(yīng)也有一定改善作用。

在上述對(duì)AA模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)中，炎癥、疼痛及關(guān)節(jié)破壞是RA的主要臨床特點(diǎn)，其中炎癥與其引起的疼痛是影響RA患者生活質(zhì)量的一個(gè)重要因素，長時(shí)間的疼痛還可使患者產(chǎn)生焦慮、抑郁、煩躁等情緒，并可導(dǎo)致睡眠障礙[14]，因此在RA的治療中對(duì)疼痛的緩解尤為重要。鉤吻總堿的鎮(zhèn)痛作用早有報(bào)道，對(duì)多種疼痛均有良好療效，其痛域提高百分率僅低于嗎啡而高于漢防己、延胡索等其他生物堿[15]，但由于其毒性強(qiáng)而受到限制。從鉤吻總堿中尋找并分離出有活性而毒性相對(duì)較低的單體是突破其應(yīng)用限制的一個(gè)途徑，神經(jīng)藥理課題組利用先期建立的分離純化工藝獲得了多種高純度鉤吻生物堿單體如鉤吻素子、鉤吻素己及1-甲氧基鉤吻堿等[16-17]，并進(jìn)行了相關(guān)藥效學(xué)及藥動(dòng)學(xué)特性等方面的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)鉤吻素子毒性低于鉤吻總堿，小鼠皮下注射鉤吻素子半數(shù)致死量(median lethal dose，LD50)為99.0 mg/kg，約為總堿的1/58，小鼠灌胃給藥LD50為203.8 mg/kg，約為鉤吻總堿的1/92.6[18]；(2)鉤吻素子也具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛效應(yīng)且無嗎啡樣藥物依賴性[19]，其對(duì)AA小鼠注射足熱痛敏的改善作用也與課題組前期報(bào)道相符；(3)鉤吻素子還具有抗焦慮作用[20]，若用于抗RA治療，可能有利于緩解RA患者由于疼痛而引起的緊張、焦慮情緒。上述研究提示，鉤吻素子對(duì)佐劑誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎具有治療作用，可能可以開發(fā)成為抗RA的新型治療藥物，相對(duì)于鉤吻總堿應(yīng)更具有應(yīng)用前景及開發(fā)價(jià)值。而其對(duì)RA的治療效應(yīng)及可能的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究確證。

綜上所述，鉤吻素子可以減輕AA小鼠的足腫脹并緩解其疼痛，同時(shí)減輕其關(guān)節(jié)破壞，對(duì)小鼠的佐劑性關(guān)節(jié)炎具有治療作用。本研究為鉤吻素子在抗RA方面可能的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)支持。

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(編輯:張慧茹)

Therapeutic Effect of Koumine on Adjuvant Arthritis in Mice

YANG Jian1,CAI Hongda2,CHEN Zehong1,FANG Menghan1,YU Changxi1

1.College of Pharmacy,Fujian Medical University,Fuzhou 350108,China；2.Department of Anesthesiology,The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China

ObjectiveTo examine the therapeutic effect of koumine on adjuvant arthritis in mice.MethodsEight days after immunization,mice with adjuvant arthritis received koumine (0.8,4,or 20 mg/kg),or indomethacin (10 mg/kg) as control through gastric gavage for 10 consecutive days.Body weight,injected paw thickness and paw withdrawal thermal latency (PWTL) were examined prior to the immunization and after the initiation of drug treatments on alternate days and followed by histological examination.ResultsAfter immunization,the body weight decreased,the injected paw thickness increased and the PWTL decreased in mice with adjuvant arthritis.Histological examinations showed that the immunized mice exhibited apparently joint structure destruction,synovial hyperplasia and inflammatory cell infiltration.Repeated intragastric administrations of koumine significantly attenuated the above physical and hyperalgesia changes observed in arthritic animals in a dose-dependent manner and inhibited the histopathological lesion.ConclusionKoumine can effectively attenuate adjuvant arthritis in mice.

gelsemium elegans；gelsemine；indole alkaloids；arthritis,experimental；arthritis,rheumatoid；mice

2016-06-16

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2016J01367)

福建醫(yī)科大學(xué)1.藥學(xué)院，福州350108；2.附屬第一醫(yī)院 麻醉科，福州350005

楊漸(1982-)，男，講師，理學(xué)碩士，福建醫(yī)科大學(xué)2012級(jí)博士研究生

俞昌喜.Email：changxiyu@mail.fjmu.edu.cn

R332；R684.3；R593.22；R917.78

A

1672-4194(2016)04-0217-05