CD8+記憶T細胞表達水平及對結核患者與潛在感染者的診斷價值

葉綏艷，劉曉鶯，樊海燕

(陜西省榆林市第一醫院，陜西 榆林 719000)

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CD8+記憶T細胞表達水平及對結核患者與潛在感染者的診斷價值

葉綏艷，劉曉鶯，樊海燕

(陜西省榆林市第一醫院，陜西 榆林 719000)

目的探討CD8+記憶T細胞在結核患者與潛在感染者血清中的表達水平及其診斷價值。方法選取30例活動性肺結核患者作為結核(TB)組，選取40例潛在感染者作為潛在感染(LTBI)組；另選取同期來進行體檢的健康人作為對照組。取3組受檢者外周血，采用流式細胞術檢測CD8+記憶T細胞的表達水平，并分析其與IFN-γ釋放水平及HRCT評分的關系。結果LTBI組和TB組患者CD8+TCM、CD8+TEMRA細胞亞群表達水平均明顯高于對照組(P均<0.05)，CD8+TEM表達水平均明顯低于對照組(P均<0.05)；且LTBI組與TB組CD8+T細胞各亞群表達水平比較差異具有統計學意義(P<0.05)。相關性分析顯示，IFN-γ釋放水平與CD8+TCM細胞亞群表達水平呈正相關性(r=0.319 8,P=0.022 7)；而CD8+記憶T細胞表達水平與HRCT評分呈負相關性(r=-0.273 4，P=0.014 0)。結論CD8+記憶T細胞表達水平的檢測有助于結核病的診斷、鑒別診斷、病情程度判斷及治療效果評估，值得在臨床上廣泛應用。

CD8+記憶T細胞；結核；潛伏感染；診斷價值

結核病(TB)是由結核分枝桿菌感染引起的一種慢性傳染病，在世界范圍內的病死率較高，目前，臨床上尚未完全明確其發病機制，但發現控制和治療結核病的關鍵是快速診療[1]。近年來研究證實，CD4+T和CD8+T細胞是抗結核保護性免疫主要依賴的細胞，在結核免疫保護中均發揮十分重要的作用[2]。記憶T細胞能再次識別相同抗原而產生二次免疫反應，對特異性抗原具有很強的記憶能力，是機體細胞內病原菌再次感染的預防基礎，故記憶T細胞的誘導對高效疫苗的產生十分關鍵[3]。目前，臨床上尚較少有文獻報道對結核分枝桿菌抗原特異性記憶T細胞亞群的抗結核免疫作用研究[4]。本研究對活動期結核病患者和潛伏感染者血清中CD8+記憶T細胞的表達情況進行了流式細胞術分析，旨在探討其在結核病診斷中的價值，為結核病發病機制的了解及防治措施的研發提供一定的參考依據。現將結果報道如下。

1　臨床資料

1.1一般資料選取2013年1月—2014年1月我院收治的30例結核病患者作為TB組，經痰涂片抗酸桿菌或結核菌培養陽性確診為肺結核，以《2001年中華醫學會結核病學分會肺結核診斷和治療指南標準》[5]為診斷依據，男16例，女14例；年齡21～64(38.3±3.5)歲。另收集同期收治PPD皮試和結核分枝桿菌抗原特異性IFN-Y ELISPOT檢測陽性的40例潛伏感染者作為LTBI組，患者的臨床癥狀不明顯，男22例，女18例；年齡20～62(37.9±3.4)歲。2組均排除感染HIV、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)者，合并心、肝、腎等重要臟器疾病者，合并糖尿病、惡性腫瘤及免疫缺陷疾病者，以及近期(4個月內)使用過免疫抑制劑或激素治療者。另選擇同期我院門診體檢健康者40例作為對照組，PPD皮試和結核分枝桿菌抗原特異性IFN-Y ELISPOT檢測均陰性，男20例，女20例；年齡19～64(38.6±4.1)歲。本研究獲得我院倫理委員會批準，入選者均簽署知情同意書。3組性別、年齡比較差異無統計學意義(P均>0.05)，具有可比性。

1.2方法采用流式細胞儀檢測CD8+記憶T細胞亞群在PBMCs中的表達水平。根據CD45RA和CCR7表達情況將CD8+記憶T細胞分為CD45RA-CCR7+中央記憶T細胞(TCM)、CD45RA-CCR7-效應記憶T細胞(TEM)和CD45RA+CCR7-效應記憶T細胞(TEMRA)。3組入組后于清晨空腹狀態下各抽取5 mL靜脈血，將其置于盛有EDTANa2的抗凝管中，采取Ficoll梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMCs)。分離完成后，在每孔內加入PBMCs細胞懸液200 μL，再依次加入含10%胎牛血清1640培養基、PMA、ionomycin各750 μL、50 ng/mL、1 μg/mL，并充分混勻，然后再孵育1 h。孵育完成后加入濃度為10 μg/mL的Brefeldin A，繼續孵育5 h。孵育完成后，采用含2%胎牛血清的PBS緩沖液對PBMCs進行沖洗，結束后依次加入CD8-PC5單克隆抗體、CCR7-PC7抗體、CD45RA-FITC單克隆抗體各3 μL、2.5 μL、7.5 μL，在4 ℃避光的條件下進行標記，約30 min。30 min后采用含2%胎牛血清的PBS緩沖液進行沖洗，再加入500 μL 2%胎牛血清的PBS緩沖液，使細胞懸浮于其中，置于4 ℃避光條件下保存，應設置相應的同型對照。抗體標記后，采用流式細胞儀(BeckmancoulterPC500)對樣本進行檢測，數據經CellQuest軟件分析，記錄陽性細胞百分率。分析CD8+記憶T細胞亞群與IFN-γ釋放水平、HRCT評分的相關性，IFN-γ水平采用ELISPOT法檢測，HRCT評分是專業人員根據CT檢查對CT征象進行評分，評分范圍為0～168分。

1.3統計學方法所有數據用SPSS 13.0統計學軟件分析，采用單因素方差分析Newman-Keuls多重比較試驗進行3組間的差異比較，采用直線相關性分析法進行相關性分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　　果

2.13組CD8+記憶T細胞亞群的表達情況比較與對照組相比，LTBI、TB組患者CD8+TCM、CD8+TEMRA細胞亞群表達水平呈顯著增加(P均<0.05)，而CD8+TEM細胞亞群表達水平顯著降低(P均<0.05)；且TB組患者的CD8+TCM、CD8+TEMRA細胞亞群表達水平高于LTBI組(P均<0.05)，CD8+TEM表達水平低于LTBI組(P<0.05)。見表1。

表1　3組CD8+記憶T細胞亞群表達情況比較

2.2CD8+記憶T細胞亞群與非特異性抗原刺激后PBMCs中IFN-γ釋放水平的相關性經直線相關性分析可知，ELISPOT法檢測的IFN-γ釋放水平與CD8+TCM表達水平之間呈正相關(r=0.319 8,P=0.022 7)，見圖1。而與CD8+TEM表達水平無相關性。

圖1　CD8+TCM細胞亞群表達水平與IFN-γ釋放水平的相關性

2.3TB患者CD8+記憶T細胞表達水平與HRCT評分的相關性經直線相關性分析可知，CD8+記憶T細胞表達水平與HRCT評分呈負相關(r=-0.273 4，P=0.014 0)。見圖2。

圖2　CD8+記憶T細胞表達水平與HRCT評分的相關性

3　討　　論

帶菌免疫是結核細胞免疫的主要特點，一旦消除結核菌，特異性細胞免疫也會隨之消失，這是由于結核菌初次感染后機體可產生記憶性T細胞，從而發揮抗結核免疫保護作用[5]。目前，臨床抗結核免疫功能檢測中最常見的是CD4+T細胞和CD8+T細胞，這兩種記憶性T細胞在抗結核免疫中發揮的作用至關重要[6]。既往CD4+T細胞及其分泌的細胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α等介導抗結核免疫保護的作用已被大量學者的研究所證實，被認為是抗結核保護性免疫的重要記憶和功能細胞[7-9]。近年來的研究發現，CD8+T細胞也能發揮很好的抗結核免疫保護作用。Wang等[10]研究發現，在不依賴CD4+T細胞的情況下，尤其是結核分枝桿菌感染的后期階段，CD8+T細胞可通過激活產生細胞因子而發揮免疫作用。Betts等[11]研究也得出了類似的結論，發現在抗病毒感染中CD8+T細胞發揮了有效的細胞應答作用。

本研究在非特異性抗原刺激CD8+T細胞的同時對細胞表面進行了抗體標記，將CD8+記憶T細胞分為TCM、TEM、TEMRA3種亞型,后兩種均為效應記憶T細胞[12]。多數學者的研究發現，TCM、TEM細胞是活動性結核患者體內發揮免疫保護作用的重要CD8+T細胞亞群[13-14]。Streitz等[15]報道，在結核病患者中，CD8+T細胞亞群TCM表達水平高于潛伏感染者，且疫苗研究結果顯示疫苗誘導結核病患者產生的抗原特異性記憶性細胞多數為TCM，提示CD8+TCM細胞介導免疫保護。本研究結果顯示，TB組患者CD8+TCM、CD8+TEMRA細胞亞群表達水平均高于LTBI、健康人，CD8+TEM細胞亞群表達水平低于LTBI組及健康人，且LTBI與健康人各細胞亞群表達水平也存在較大差異，說明結核病、潛伏感染者及健康人不同人群CD8+T細胞表型的表達水平存在較大差異。這與結核病患者免疫力下降、CD8+T細胞應答能力減弱密切相關，抗原特異性TEMR能直接溶解巨噬細胞而抑制結核菌增殖，故其高水平表達有利于抗結核免疫；TEM細胞表達水平的降低與結核桿菌感染后的破壞密切相關，細胞數量及功能均會受到影響，因而抗結核作用降低。可考慮將CD8+T細胞表達水平作為結核病診斷及與潛伏感染鑒別診斷的指標。

本研究還對CD8+T細胞亞群表達水平與IFN-γ釋放水平的相關性進行了分析，結果顯示，IFN-γ水平與CD8+TCM表達水平呈現出正相關性，而與CD8+TEM表達水平未呈現出相關性，IFN-γ釋放隨CD8+T細胞表達水平的增加而增多，進一步提示IFN-γ可能主要由TCM細胞產生，兩者表達水平的同時升高預示抗結核免疫感染中結核菌抗原誘導的TCM可發揮重要作用，尤其是二次感染中。本研究針對患者肺部病理學損傷程度進行了HRCT評分，并分析與CD8+T細胞表達水平的相關性，結果發現兩者呈負相關性，表明在CD8+T細胞可作為免疫學指標用于TB病情嚴重程度的診斷。

綜上所述，結核病與潛伏感染者CD8+記憶T細胞亞群表達存在較大差異，為兩者的臨床鑒別診斷提供了新的方法, 值得進一步研究。

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2016-04-10