舌鱗狀細胞癌不同浸潤方式增殖性研究

高志彪，呼海燕，王原明，白振西，楊　蘭

(1.延安大學附屬醫院，陜西 延安 716000;2.蘭州大學第二醫院，甘肅 蘭州 730030)

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舌鱗狀細胞癌不同浸潤方式增殖性研究

高志彪1，呼海燕1，王原明1，白振西1，楊蘭2

(1.延安大學附屬醫院，陜西 延安 716000;2.蘭州大學第二醫院，甘肅 蘭州 730030)

目的探討舌鱗狀細胞癌(下稱舌癌)不同浸潤方式增殖性差異及臨床意義。方法將43例舌癌蠟塊進行浸潤方式分型,以Ki67表達、S期細胞比例(SPF)等反映腫瘤細胞增殖活性為觀察指標，分別采用免疫組化SP法、流式細胞術(FCM)檢測舌癌不同浸潤方式Ki67的表達情況和細胞周期中不同S期細胞比例。結果Ki67的表達與腫瘤的浸潤方式有關，Ⅲ、Ⅳ型浸潤方式的舌癌細胞Ki67表達顯著高于Ⅰ、Ⅱ型(P均<0.05)，且臨床上易發生頸淋巴結轉移；舌癌不同浸潤方式SPF各不相同，隨著浸潤分型的進展SPF逐漸上升，差異有統計學意義(P<0.05)。結論Ki67表達和SPF與浸潤方式有關，浸潤分型越高，Ki67表達越強，SPF越高，即增殖性越強。浸潤方式可作為舌癌惡性程度的有效指標之一，有助于判斷舌癌的淋巴結轉移情況，為臨床治療方案設計提供依據。

舌鱗狀細胞癌；浸潤方式；增殖性

舌癌在口腔癌發病率中占首位，轉移和術后復發是患者死亡的主要原因[1-2]，對早期轉移淋巴結的處理是提高患者生存率的關鍵。一直以來，組織病理分級是以細胞形態學為基礎的，是腫瘤惡性程度判斷的金標準，但因其有較大的主觀性和不確定性受到臨床醫師質疑[3-4]。1973年Jakobsson等[5]提出了半定量病理多因素分級系統，首次提出了頭頸部鱗癌4型浸潤方式概念。1987年Anneroth等[6]對該分級系統進行了改進，強調了腫瘤與周圍組織交界面的關系，提出腫瘤浸潤方式在評價腫瘤惡性程度和預測區域淋巴結轉移中扮演重要角色，主要包括腫瘤細胞的角化程度、核異型性、浸潤方式及結締組織中炎性細胞的浸潤情況等。本研究以舌癌為研究對象，按Anneroth等[6]介紹的方法作浸潤方式分型，分別采用免疫組化技術和FCM從宏觀和微觀兩個不同層面探討舌癌不同浸潤方式腫瘤細胞的增殖情況，并探討舌癌原發灶浸潤方式分型在預測腫瘤惡性度及腫瘤轉移中的價值。

1　研究資料

1.1一般資料收集臨床資料完整、病例診斷確切、病理切片能反映腫瘤-宿主交界情況的舌癌蠟塊43例，所有患者術前未行放化療。其中男28例，女15例；年齡34～72歲。實驗所用蠟塊行5 μm厚組織切片，常規HE染色，雙盲法閱片，由2名高級職稱病理科醫師按Anneroth方法作原發灶浸潤方式分型和傳統腫瘤組織病理分級：Ⅰ型14例，Ⅱ型13例，Ⅲ型10 例，Ⅳ型6例；病理分化程度：高分化23例，中分化6例，低分化14 例；有淋巴結轉移17例，未轉移26例。

1.2SP法免疫組化染色浸潤分型后所有蠟塊重做5 μm厚組織切片，SP法免疫組化染色。鼠抗人細胞核抗原Ki67單克隆抗體，SP通用型試劑盒均購自北京中杉生物技術公司。染色方法按試劑盒提供的說明進行。以0.01 mol/L PBS代替一抗為空白對照。

1.3單細胞懸液DNA熒光染色及上機檢測浸潤分型后所有蠟塊再次行50 μm厚組織切片，依次二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，胃蛋白酶消化，過濾，離心，漂洗，75%乙醇固定后，離心、去上清、用碘化丙啶(PI)一步插入性DNA定量熒光染色，避光反應30 min后，用美國BECKMAN COULTE公司的Epics XL型流式細胞儀檢測，上機前儀器需校正，使其峰值的分辨率(CV值)<5%。以正常舌體組織單細胞懸液作對照。

1.4舌癌浸潤方式分型及組織病理分級浸潤方式按Anneroth等[6](1987)判定標準進行分型。Ⅰ型:腫瘤細胞呈“推擠狀”(pushing)生長，腫瘤與正常組織邊界清晰,；Ⅱ型:腫瘤細胞呈實性條索或帶狀向周圍正常組織侵襲；Ⅲ型:腫瘤瘤細胞排列成較大細胞團塊浸潤正常組織； Ⅳ型:腫瘤細胞呈小細胞團塊或單細胞彌散于正常組織中。按WHO( 1997年)標準將口腔鱗狀細胞癌分為3級，高分化(一級)：角化明顯，核分裂象少，非典型核分裂和多核細胞極少，胞核和細胞多形性不明顯；中度分化(二級)：形態學介于高分化與低分化之間，角化較少，細胞及核多形性較明顯，核分裂象較多，可見異常核分裂象，細胞間橋不顯著；低度分化(三級)：角化少見，細胞間橋幾乎不能發現，細胞及核多形性明顯，多核細胞常見。

1.5Ki67陽性細胞數判定及計數Ki67表達陽性為腫瘤細胞核著色為棕黃色或棕褐色而背景不著色。每張切片由2名病理科醫生閱片，觀察5個有代表性且不重疊的高倍視野(10×40)，并計數每個視野中腫瘤細胞Ki67陽性表達細胞數，取其均數計算Ki67陽性細胞百分率值(Label Index,LI)，即Ki67標記指數(Ki67 LI)。

1.6FCM分析指標用Mod Fit LT分析軟件分析細胞周期，測定S期細胞比例(SPF)，公式：SPF(%)=S/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.7統計學方法采用SPSS 10.0統計學軟件對計量資料行t檢驗，計數資料行2檢驗。檢驗水準α=0.05。

2　結　　果

2.1Ki67免疫組化染色結果舌癌腫瘤細胞核出現棕黃色或棕褐色顆粒為Ki67表達陽性。Ⅰ、Ⅱ型浸潤方式者癌巢周圍1～3層細胞Ki67呈陽性表達而癌巢中央不表達(見圖1及圖2)，Ⅲ、Ⅳ型浸潤方式者腫瘤細胞Ki67陽性表達呈散在分布于整個癌巢，且著色深淺不一(見圖3及圖4)。

圖1Ⅰ型浸潤方式Ki67表達(SP，×100)

圖2Ⅱ型浸潤方式Ki67表達(SP，×100)

圖3Ⅲ型浸潤方式Ki67表達(SP，×100)

2.2浸潤方式與Ki67表達及SPF的關系隨著浸潤分型Ⅰ型向Ⅳ型的發展，Ki67標記指數和SPF表達逐漸升高，舌癌各分型間比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

圖4Ⅳ型浸潤方式Ki67表達(SP，×100)

表1　浸潤方式與Ki67表達及SPF的關系，%)

2.3浸潤方式與淋巴結轉移的關系43例舌癌病例中有淋巴結轉移者17例，其中Ⅰ、Ⅱ型浸潤方式27例中淋巴結轉移7例，陽性率為25.93%(7/27)；Ⅲ、Ⅳ型浸潤方式16例中淋巴結轉移10例，陽性率為62.50%(10/16)。Ⅰ、Ⅱ型與Ⅲ、Ⅳ型浸潤方式之間淋巴結轉移率比較差異有統計學意義(P均<0.05)。

2.4浸潤方式與組織病理分化程度關系Ⅰ、Ⅱ型浸潤方式者高分化20例，中、低分化7例；Ⅲ、Ⅳ型浸潤方式者高分化3例，中、低分化13例。Ⅰ、Ⅱ型浸潤方式和Ⅲ、Ⅳ型浸潤方式之間病理分化程度比較差異有統計學意義(P均<0.05)。

3　討　　論

腫瘤的大小、部位、生長模式和細胞分化程度一直被認為是與腫瘤轉移高度相關的因素。近年來的研究表明腫瘤的浸潤方式在其淋巴結轉移過程中扮演著重要角色，是預測淋巴結轉移的最好指標[7]。事實上惡性腫瘤本身是由不同病理表現形式及生物學行為的亞細胞群組成，其浸潤過程極其復雜,腫瘤的異質性可導致同一腫瘤實體內細胞分化呈現多樣性，這種細胞學形成的特定表現完全可能與其浸潤及轉移能力間存在內在聯系。本研究結果顯示，舌癌不同浸潤方式與舌癌病理分化程度(惡性度)有關，Ⅲ、Ⅳ型浸潤者比Ⅰ、Ⅱ型浸潤者有較高的淋巴結轉移率。

Ki67抗原是近年來一種反映細胞增殖活性的蛋白標記，研究發現[8]Ki67作為一種細胞分裂增殖指標可很好地反映細胞的增殖狀態。Ki67蛋白除在細胞周期靜止期(G0期)表達缺失外，在活躍的細胞周期中都有表達，且在G2和M期表達至高峰[9]。檢測Ki67的表達可間接反映腫瘤細胞的增殖潛能。同樣在細胞DNA周期中S期細胞比例也是反映細胞增殖水平的重要指標, 據Collin等研究顯示頭頸部腫瘤S期細胞增殖率為4%～45%(平均19%)，并隨分化程度降低而呈現升高趨勢[10]。本研究發現舌癌不同浸潤方式的腫瘤細胞具有不同的增殖活性，浸潤邊緣為推擠狀或團塊狀實體條索狀者(Ⅰ、Ⅱ型)Ki67表達較低，而以小細胞群或單個細胞彌散狀侵襲者(Ⅲ、Ⅳ型)Ki67表達較高，且Ⅰ、Ⅱ型浸潤者比Ⅲ、Ⅳ型浸潤者淋巴結轉移率低，另外浸潤分型越高者，腫瘤組織分化越低。同樣，不同浸潤方式舌癌SPF各不相同，Ⅰ、Ⅱ型和Ⅲ、Ⅳ型之間差異有統計學意義，這從另一個角度反映了浸潤分型高的舌癌組織具有較高的增殖活性，侵襲性更強，淋巴結轉移率高，與免疫組化試驗相吻合，即舌癌浸潤分型越高，其癌細胞增殖性越強，提示舌癌浸潤前沿是癌細胞增殖最活躍、分化最差的部位。因此，舌癌不同浸潤方式的分型在一定程度上反映了腫瘤的惡性程度，能間接預測舌癌淋巴結轉移情況。

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10.3969/j.issn.1008-8849.2016.27.031

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1008-8849(2016)27-3050-03

2016-01-22