激發型CD28單抗參與誘導的CIK對乳腺MDA-MB-231、MCF-7細胞的殺傷作用研究

鄭瀟然,白吉明,李建輝,王　翔,錢　浩,王新杰,李建華

(河北省承德市中心醫院暨承德醫學院第二附屬醫院,河北 承德 067000)

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激發型CD28單抗參與誘導的CIK對乳腺MDA-MB-231、MCF-7細胞的殺傷作用研究

鄭瀟然,白吉明,李建輝,王翔,錢浩,王新杰,李建華

(河北省承德市中心醫院暨承德醫學院第二附屬醫院,河北 承德 067000)

目的觀察激發型CD28單抗參與誘導的殺傷細胞(CIK)的增殖能力、表型特征及對乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細胞株的殺傷作用。方法制備鼠抗人激發型CD28單抗，采用激發型CD28單抗參與CIK的誘導，觀察CIK細胞的增殖能力及表型特征；采用CCK-8法檢測激發型CD28單抗參與誘導的CIK對乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細胞株的殺傷率，采用流式細胞術檢測乳腺癌細胞的凋亡率。結果激發型CD28單抗能明顯促進CIK細胞的體外增殖且能明顯上調具有腫瘤殺傷活性的T細胞比例；CCK8檢測發現，激發型CD28單抗誘導的CIK對乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7的殺傷率均高于對照組(P均<0.05)，且殺傷率隨效靶比升高，并確定20∶1為最終效靶比；流式細胞術檢測發現，加入激發型CD28單抗誘導的CIK，可提高乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7的凋亡率及壞死率(P均<0.05)。結論激發型CD28單抗參與誘導的CIK能明顯提高CIK的增殖能力及上調具有腫瘤殺傷活性的T細胞比例，增強對乳腺癌細胞的殺傷能力，可能為乳腺癌的免疫治療提供新思路。

激發型CD28單抗；細胞因子誘導的殺傷細胞；乳腺癌

乳腺癌是常見的惡性腫瘤，治療方法主要有手術治療、化療、放療及內分泌治療等。近年來，乳腺癌的免疫治療成為研究熱點，且國內外有許多關于乳腺癌免疫治療的實驗研究并取得了顯著進展[1-3]。細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)因其具有較高的體外增殖活性及細胞毒活性，為腫瘤的免疫治療提供了新思路。目前，已有諸多研究將CIK應用于肝癌[4]、腎癌[5]、胃癌[6]、惡性淋巴瘤[7]等惡性腫瘤的免疫治療中并取得一定進展，但許多研究也發現CIK治療惡性腫瘤的臨床反應率不高，且部分治療無效[8]。因此，如何提高CIK免疫治療抗腫瘤的敏感性，獲得足夠數量、高效的CIK以滿足臨床需要成為當前研究的難點和關鍵。CD28是在人T細胞及部分NK細胞表面表達的重要分子，具有激發T細胞增殖與發揮免疫效應的作用。激發型的CD28抗體能與細胞表面的CD28分子相結合，直接傳導細胞的活化信號，起到促進細胞增殖及發揮免疫效應作用。所以，本研究通過自行制備激發型CD28單抗，并聯合不同細胞因子體外誘導CIK細胞，以分析CIK細胞經激發型CD28單抗誘導后的增殖能力、表型特征及對乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細胞的殺傷作用，為尋找安全、高效的CIK擴增方案提供依據。

1　實驗資料

1.1主要儀器和試劑細胞培養板(Coabar，美國)，細胞培養瓶(Corning，美國)，流式細胞儀(Beckman，美國)，CO2培養箱(SANYO，日本)，Model680型酶標儀(Bio-Rad公司)，ProteinA親和層析純化儀(BioRad，美國)。胎牛血清和小牛血清(Gibco，美國)，DMEM培養基(美國，Gibco)，RPMI-1640 (美國，Gibco)，抗性篩選藥物G418(Invitrogen，美國)，PE標記的鼠抗人CD28單克隆抗體(Novus，美國)，Pristane(Sigma，美國)，基因重組人IL-2、基因重組人INF-γ(Sigma，美國)，淋巴細胞分離液(南京凱基生物制品公司，中國)，激發型CD28單抗(自行制備)，激發型CD3抗體(Becton Dickinson 公司，美國)，CD4-FITC、CD8-FITC、CD56-PE(Beckmen Coulter，美國)，FITC標記羊抗鼠IgG熒光抗體(Beckmen Coulter，美國)，CCK-8試劑盒(dojindo，日本)；Annexin-V-FITC/PI 試劑盒(Pharmigen，美國)。其他試劑均為國產分析純。

1.2實驗標本BALB/c小鼠，購自上海實驗動物中心；穩定分泌鼠抗人激發型CD28單抗的雜交瘤細胞株18G8(IgG2a，κ型)，購于上海中科院細胞所；轉人CD28基因的細胞株CD28T，購于上海中科院細胞庫；人惡性B淋巴瘤細胞株Daudi，購于美國ATCC公司；乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7購于上海中科院細胞庫。

1.3實驗方法

1.3.1激發型CD28單抗的制備參照文獻[9]方法制備。采用小鼠體內誘生腹水的方法產生單克隆抗體，取8周齡雌性BALB/c小鼠，腹腔注射Pristane 0.5 mL/只；于注射1周后腹腔注射雜交瘤細胞1×107/只，同時另一側腹腔再注射Pristane 0.2 mL/只，并輕柔按摩小鼠腹部，使雜交瘤細胞分散于小鼠腹腔中。于7～10 d后收獲小鼠腹水，小鼠腹水陽性形成率約為85%，每只小鼠腹水收獲量約為2 mL，并離心取上清液。采用ProteinA免疫親和層析法純化腹水，得到抗體蛋白約為1.0 mg/mL腹水，并采用流式細胞術測定單克隆抗體的效價，備用。

1.3.2激發型CD28單抗參與CIK誘導方法從志愿者抗凝全血中分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC )，并接種于激發型鼠抗人CD3單抗包被24孔板，同時加入細胞因子，在37 ℃、5%CO2培養箱中培養。實驗分為2組：對照組加anti-CD3+IL-2+IFN-γ，實驗組加anti-CD3+anti-CD28+IL-2+IFN-γ，其中CD3單抗1 μg/mL、細胞因子IL-2 0.1萬IU/mL、激發型CD28單抗0.5 μg/mL、IFN-γ 100 ng/mL。于誘導7 d后收集的CIK細胞即為效應細胞，一部分效應細胞備用研究對乳腺癌細胞的殺傷作用，另一部分效應細胞分別標記實驗組單克隆抗體CD4-FITC、CD8-FITC、CD56-PE(對照組標記Ig G1-FITC、IgG1-PE)及帶有2種熒光的單克隆抗體CD4-FITC/CD25-PE、CD8-FITC/CD25-PE、CD4-FITC/FasL-PE、CD8-FITC/Fas L-PE(對照組標記Ig G1-FITC、Ig G1-PE)，采用流式細胞儀檢測CIK細胞上CD4+、CD8+、CD56+及CD4+CD25+、CD8+CD25+、CD4+FasL+、CD8+FasL+的表達情況。

1.3.3激發型CD28單抗參與的CIK對乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細胞殺傷作用檢測參照文獻[10]方法，采用CCK-8法檢測。將上述實驗制備的效應細胞即激發的CIK細胞與乳腺癌細胞MDA-MB-231、MCF-7以5∶1，10∶1，20∶1的效靶比加入96孔板進行培養，同時設陰性對照組(只加入靶細胞)與空白對照組(只加入培養基)，在37 ℃、5% CO2條件下培養72 h后，吸棄CIK，并加入CCK-8，完全溶解后, 用酶聯免疫儀在波長490 nm處讀取吸光度值(OD值)，以確定最終確定效靶比，實驗中每組設置6個平行孔，并進行3次獨立重復實驗。細胞殺傷率(%)=(CIK組OD值-陰性對照組OD值)/(陰性對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。

1.3.4Annexin V/PI染色法檢測細胞凋亡按照CCK-8確定的最終效靶比，將CIK與靶細胞接種入24孔板，培養72后，收集細胞，采用Annexin V/PI染色法對MDA-MB-231、MCF-7細胞進行染色，于流式細胞儀檢測細胞的凋亡率及壞死率，每組設3個平行樣，并進行3次獨立重復實驗。

2　結　　果

2.1激發型CD28對CIK增殖能力及活化細胞模型分子表達的影響培養7 d后,實驗組和對照組CIK的細胞總量分別為(8.1±2.7)×106/孔和(2.3±1.4)×106/孔，差異有統計學意義(t=3.303，P=0.001)。采用流式細胞術單標法分析發現，實驗組CIK細胞中CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD56+T細胞比例均明顯高于對照組(P均<0.05)，見表1；采用流式細胞術雙標法分析發現，實驗組CIK細胞中CD4+CD25+T細胞、CD8+CD25+T細胞、CD4+FasL+T細胞、CD8+FasL+T細胞的比例均明顯高于對照組(P均<0.05)，見表2。

表1　激發型CD28對CIK增殖能力的影響

表2　激發型CD28對CIK細胞表型特征的影響

2.2激發型CD28單抗誘導的CIK對乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7的殺傷作用CCK8檢測結果發現，激發型CD28單抗誘導的CIK對乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7的殺傷率均高于對照組(P均<0.05)，且殺傷率隨效靶比升高，但效靶比為40∶1時，殺傷率上升已不明顯，所以綜合殺傷效果和經濟因素考慮確定20∶1為最終效靶比，見表3；按CCK-8實驗確定的20∶1的效靶比進行凋亡實驗，結果發現激發型CD28單抗誘導的CIK誘導的乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7的凋亡率及壞死率均高于對照組(P均<0.05)，見表4。

3　討　　論

表3　激發型CD28單抗誘導的CIK對乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7殺傷作用

表4　激發型CD28單抗誘導的CIK對乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7凋亡的影響

CIK是將人外周血單個核細胞在體外經多種細胞因子刺激后產生的一群異質細胞，具有T淋巴細胞強大的抗癌活性及NK細胞非組織相容性抗原復合物(MHC)限制性殺傷腫瘤細胞的特點[11-12]。目前，CIK已經突破淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)、抗CD3單克隆抗體(mAb)激活的殺傷細胞(CD3AK)、細胞毒性T細胞(CTL)等擴散速度慢、毒力低、來源難等局限，成為腫瘤免疫治療的首選方案[13-14]。CIK在健康人和腫瘤患者外周血中的數量較低，需在體外經多重細胞因子誘導培養后大量擴增；在腫瘤患者中，CIK數量更低，需擴增后再回輸才能達到抗腫瘤的目的[15]。有研究發現，將人外周血單個核細胞在體外經多種細胞因子誘導后，數量明顯增加，而且T細胞亞型的比例也發生改變：具有腫瘤殺傷活性的T細胞比例明顯升高，抑制性T細胞比例則明顯降低[16]。

本研究結果發現，激發型CD28單抗能明顯促進CIK細胞的體外增殖。CIK細胞中細胞表型的比例變化是評價CIK細胞抗腫瘤療效和質量的重要指標。本研究免疫熒光單標法發現，激發型CD28單抗參與誘導的CIK細胞中CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD56+T細胞均明顯升高，而CD4主要表達于輔助T細胞(T helper cells，Th)，CD8主要表達于細胞毒性T細胞(cytotoxic T cell，CTL)，CD56主要表達于自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)，說明激發型CD28單抗能夠明顯提高Th、CTL、NK的比例，使經誘導CIK殺傷活性增強。通過免疫熒光雙標法發現，實驗組CIK細胞中CD4+CD25+T細胞、CD8+CD25+T細胞、CD4+FasL+T細胞、CD8+FasL+T細胞的比例均明顯升高，CD25主要分布于活化的T細胞表面，是T 細胞活化的標志，而FasL只表達于活化的T淋巴細胞即CTL細胞，通過與靶細胞(腫瘤細胞)表面Fas結合，通過Fas觸發靶細胞內部的凋亡程序，使靶細胞(腫瘤細胞)發生程序性細胞死亡即凋亡或壞死。因此說明激發型CD28單抗能夠提高CIK對腫瘤細胞的殺傷能力。本研究還發現，CIK經體外誘導后對乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7均有殺傷作用，這與文獻[17-18]的研究結果一致；同時研究中還發現，激發型CD28單抗誘導的CIK對乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7的殺傷率更高，且MDA-MB-231、MCF-7凋亡率及壞死率也明顯升高，說明激發型CD28單抗誘導增強了CIK的殺傷活性，這與本研究中激發型CD28單抗改變CIK細胞表型的變化相一致。本研究中也發現激發型CD28單抗明顯上調了CIK中FasL分子的表達，但具體乳腺癌細胞株MDA-MB-231、MCF-7的凋亡率增加與FasL是否有關還需要進一步對乳腺癌細胞凋亡相關的蛋白進行研究。

綜上所述，CIK治療乳腺腫瘤具有廣闊的應用前景，且激發型CD28單抗參與誘導的CIK能明顯提高CIK的增殖能力及上調具有腫瘤殺傷活性的T細胞比例，增強對乳腺癌細胞的殺傷能力，可能為乳腺癌的免疫治療提供新思路。

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Study on the killing effect to MDA-MB-231 and MCF-7 breast cancer cells of CIK induced by agonist monoclonal antibody against human CD28

ZHENG Xiaoran, BAI Jiming, LI Jianhui, WANG Xiang, QIAN Hao, WANG Xinjie, LI Jianhua

(The Second Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde 067000, Hebei, China)

Objective It is to observe the proliferation ability, cell phenotype characteristics and killing effect to human breast cancer cell line MDA-MB-231, MCF-7 of CIK induced by agonist monoclonal antibody against human CD28.Methods Mouse anti-human CD28 mAb was prepared and used to involve in inducing CIK, and the proliferation ability and cell phenotype characteristics of CIK were tested; the killing rate and apoptosis rate to breast cancer cell line MDA-MB-231, MCF-7 were detected by CCK-8 assay and flow cytometer.Results Agonist monoclonal antibody against human CD28 obviously promoted the CIK cells proliferation in vitro and increased the proportion of T cells with tumor killing activity.CCK8 testing found that, the killing rate of CIK induced by agonist monoclonal antibody against human CD28 to breast cancer cell line MDA-MB-231, MCF-7 were higher than control group (all P<0.05), and in a dose-dependent manner, and the effect-target of 20 to 1 was determined for the final effect; Flow cytometry showed that, the apoptosis rate and necrosis rate of breast cancer cell line MDA-MB-231, MCF-7 were increased with the addition of CIK involved by agonist monoclonal antibody against human CD28 in the induction (all P<0.05).Conclusion CIK involved by agonist monoclonal antibody against human CD28 in the induction can significantly improve the proliferation ability of CIK and the proportion of T cells with tumor killing activity, and enhance the ability to kill breast cancer cells, and may provide new ideas of immune therapy to breast cancer.

agonist monoclonal antibody against human CD28; cytokine-induced killer; breast cancer

鄭瀟然，女，研究生，研究方向為乳腺癌生物治療。

李建華,E-mail:lj_hua1963@163.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.27.010

R-33

A

1008-8849(2016)27-2995-04

2016-04-25