人腸三葉因子重組真核表達載體的構建及在CHO/dhfr-細胞中的穩定表達

朱融和，陳慧瑤，莊強，江松福

（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325015，1.兒科；2.血液內科）

?

人腸三葉因子重組真核表達載體的構建及在CHO/dhfr-細胞中的穩定表達

朱融和1，陳慧瑤2，莊強2，江松福2

（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325015，1.兒科；2.血液內科）

目的：構建人腸三葉因子（hITF）重組真核表達載體，并檢測其在CHO/dhfr-細胞中的表達。方法：通過重疊延伸PCR法獲得hITF cDNA片段，將目的基因插入真核表達載體pIRES/dhfr，得到重組真核表達載體pIRES/hITF/dhfr；經脂質體介導轉染CHO/dhfr-細胞，通過G418篩選，建立穩定轉染的CHO/dhfr-細胞系；用RT-PCR及ELISA法檢測hITF的表達。結果：成功構建了重組真核表達載體pIRES/hITF/dhfr，并建立了穩定轉染的CHO細胞系，成功地表達了目的基因。結論：成功構建了重組真核表達載體pIRES/hITF/dhfr，并在CHO/dhfr-細胞中分泌表達hITF蛋白，為進一步進行重組hITF的臨床前研究奠定良好的實驗基礎。

人腸三葉因子；真核表達載體；CHO/dhfr-細胞

人腸三葉因子（human intestinal trefoil factor，hITF）屬于三葉因子家族中的一員，由59個氨基酸殘基構成，其中含有6個高度保守的半胱氨酸序列，形成3對二硫鍵，從而產生特異而穩定的三葉草結構，這種穩定的結構，使其不受消化酶及pH值的影響，確保在胃腸道中發揮作用。體內外實驗［1-3］證實，hITF是一種重要的胃腸黏膜保護因子，其作用可能是通過與黏液糖蛋白形成穩定的凝膠層復合物，保證了腸道屏障的完整性。目前多采用基因重組的方法獲得hITF。國內報道［4］在大腸桿菌中表達出重組hITF，表達量為3～4 mg/L，但缺乏必要的折疊、修飾等后期加工，蛋白活性大大降低。本研究通過構建重組真核表達載體，轉染CHO/ dhfr-細胞，G418篩選獲得穩定表達細胞克隆，并對表達產物進行鑒定，為進一步進行重組hITF的臨床前研究奠定良好的實驗基礎?！?br>