Dectin-1受體、白細胞介素-17及白細胞介素-12在小鼠巨噬細胞活化后真菌性角膜炎中的表達

董騁寰， 鄭曉倩， 徐國興

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Dectin-1受體、白細胞介素-17及白細胞介素-12在小鼠巨噬細胞活化后真菌性角膜炎中的表達

董騁寰， 鄭曉倩， 徐國興

目的檢測小鼠活化巨噬細胞真菌性角膜炎中的人樹突狀細胞源性C型凝集素樣受體-1(Dectin-1)受體、白細胞介素-17(IL-17)及白細胞介素-12(IL-12)的表達水平。方法分別向小鼠角膜創口內注入乳膠微粒液或PBS液構成實驗組與對照組。于感染后第1,3,5,7,9 d，裂隙燈顯微鏡下觀測各組小鼠真菌性角膜炎特點，H-E染色觀測其病理特征；通過Realtime-PCR檢測小鼠角膜中Dectin-1受體、IL-17及IL-12基因mRNA的表達。結果(1)實驗組角膜浸潤混濁，于第7天多發穿孔，未發現新生血管；對照組角膜混濁，于第5天廣泛分布新生血管，未發現穿孔。(2)實驗組角膜大量炎癥細胞匯集，第5天基質細胞排列紊亂，破壞嚴重。(3)Realtime-PCR結果表明感染后第3,5,7,9 d，實驗組Dectin-1受體、IL-17、IL-12基因mRNA的表達量顯著高于對照組(P<0.05)。結論Dectin-1受體、Th1及Th17細胞免疫可能在角膜抵御真菌感染的機制中發揮重要作用。

角膜炎； 眼感染，真菌性； 巨噬細胞； 凝集素類； Th1細胞/免疫學； T淋巴細胞； 白細胞介素類

真菌性角膜炎是一種影響廣泛、易導致失明的眼表疾病。正常角膜中不存在巨噬細胞。當感染真菌時，巨噬細胞上的人樹突狀細胞源性C型凝集素樣受體-1(Dectin-1)受體通過識別真菌表面的β-(1,3)-葡聚糖，激活巨噬細胞向病變組織浸潤聚集并驅動Th1及Th17細胞應答。Dectin-1受體、Th1及Th17細胞應答參與機體清除真菌感染，但在真菌性角膜炎中的機制尚不明確。

本研究通過模擬小鼠巨噬細胞活化后真菌性角膜炎，觀測小鼠真菌性角膜炎的臨床、病理特征及各階段Dectin-1受體、白細胞介素-17(interleukin-17,IL-17)及白細胞介素-12(interleukin-12,IL-12)的表達情況，研究Dectin-1受體、IL-17、IL-12在真菌性角膜炎中發揮的作用。

1　材料與方法

1.1動物5～6周已排除全身疾病的清潔級Balb/c小鼠100只[許可證編號：SCXK(滬)2007-0005]，體質量19～20 g，不限雌雄，隨機分為實驗組和對照組各50只；30只已排除全身疾病的Sprague-Dawley(SD)大鼠(角膜植片用)[許可證編號：SCXK(滬)2007-0005]，體質量200～250 g。

1.2方法

1.2.1菌株標準茄病鐮刀菌(中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號：3.2889)，28 ℃于下Sabouroud培養基內培育7 d后，采用無菌PBS液稀釋菌液至濃度1×106CFU/mL。

1.2.2建立活化巨噬細胞后真菌性角膜炎模型眼科常規消毒麻醉后，于小鼠角膜表面刮出長約1 mm、深達淺基質層的創口。實驗組向創口內注入乳膠微粒液8 μL，對照組注入PBS液8 μL，其余步驟與實驗組一致。繼續飼養1周后，依據表層鏡法，用圓刀片刮除各組角膜上皮(直徑約1.5 mm)，覆蓋直徑約2 mm大鼠角膜植片，植片與角膜層間注入10 μL真菌液，縫合瞼緣，再注入真菌液5 μL，術后結膜囊涂氧氟沙星眼膏預防其他感染，于24 h后拆除植片[1]。

1.2.3真菌性角膜炎模型的鑒定小鼠縫線拆除后，模型成活100只，隨機抽取實驗組小鼠，刮取潰瘍病灶，行真菌培養并鑒定菌種，同時排除細菌性角膜炎。

1.2.4角膜炎形態觀察病原感染后第1,3,5,7,9 d，裂隙燈顯微鏡下觀測各組角膜炎的面積大小、密度、表面的規則度，參考HU的評分標準進行臨床評分，3個指標的所得分數相加即為總分。正常的角膜記0分，角膜輕度感染記1～4分，角膜中度感染記5～8分，角膜重度感染記9～12分[1]。

1.2.5實驗室檢測于感染后第1,3,5,7,9天，角膜組織切片行H-E染色組織病理學檢測、免疫組織化學檢測F4/80細胞(巨噬細胞)、Realtime-PCR檢測Dectin-1受體、IL-17、IL-12基因mRNA的表達，PCR引物序列及擴增產物大小見表1。

表1　小鼠PCR引物序列及擴增產物的長度

Dectin-1受體:人樹突狀細胞源性C型凝集素樣受體-1； IL-17：白細胞介素-17； IL-12：白細胞介素-12.

1.3統計學處理采用SPSS 17.0軟件分析數據，組內及組間的比較采用重復測量方差分析，P<0.05為差別具有統計學意義。

2　結　果

2.1真菌性角膜炎形態觀察及炎癥評分感染后第1天實驗組角膜中央輕度水腫；第3天角膜輕度隆起水腫伴霧狀混濁；第5天角膜明顯苔蘚樣混濁，直徑約1 mm，角膜表面凹凸不平，周圍伴有混濁環形浸潤；第7天角膜中央潰瘍、明顯有水腫，伴壞死病灶或穿孔；第9天浸潤混濁多發穿孔，未見新生血管。對照組第1天角膜輕度水腫，第3及5天角膜白色混濁；第7及9天角膜中央輕度水腫伴灰白色混濁，新生血管廣泛分布，角膜未出現壞死穿孔，各組巨噬細胞活化后小鼠真菌性角膜炎癥評分見表2。

表2　巨噬細胞活化后小鼠真菌性角膜炎實驗組和對照組臨床評分

2.2活化的巨噬細胞分布小鼠F4/80細胞是小鼠單核巨噬細胞的特異性單克隆抗體，若小鼠角膜上無單核巨噬細胞分布，則角膜無陽性F4/80細胞。小鼠真菌性角膜炎感染后各時間點角膜及前房可見大量陽性F4/80細胞分布。

2.3H-E染色結果感染后實驗組第1,3,5天角膜及前房大量炎癥細胞匯集，第5天后伴發角膜基質纖維排列紊亂；對照組第1,3,5天小鼠角膜炎癥細胞浸潤，第5,7天炎癥細胞減輕，新生基質纖維細胞生長見圖1。

2.4小鼠角膜中Dectin-1受體及IL-17、IL-12基因mRNA檢測結果感染后第3,5,7天實驗組IL-17、IL-12、Dectin-1受體表達量不斷上調，且實驗組顯著高于對照組(P<0.05)；感染后第3,5天IL-17的表達高于IL-12(P<0.05)，于第7天達到頂峰；IL-12、Dectin-1受體的表達持續上調，于第9天達頂峰(表3)。

表3Dectin-1受體、白細胞介素-17及白細胞介素-12基因mRNA水平

Tab 3mRNA level of Dectin-1 receptor, IL-17 and IL-12 genes

n=6. Dectin-1受體：樹突狀細胞相關性C型凝集素-1受體； IL-17：白細胞介素-17；IL-12：白細胞介素-12. 實驗組與對照組指標各截點比較，#：P<0.05.

3　討　論

小鼠角膜Dectin-1受體是主要的模式識別受體(pathogen recognition receptors,PRRs)之一，分布于單核巨噬細胞、中性粒細胞上，能夠識別煙曲霉病原體相關分子模式(pathogen associated molecular patten,PAMP)即β(1,3)-葡聚糖，參與對煙曲霉菌的識別、殺菌等作用[2]。研究表明，Dectin-1識別真菌β-(1,3)-葡聚糖后誘導吞噬細胞激活聚集及產生細胞因子，以抵抗曲霉菌感染[3]。Dectin-1受體還參與了小鼠獲得性免疫及其細胞因子的炎癥反應。Dectin-1受體能直接驅動小鼠獲得性免疫，包括小鼠Th1細胞和Th17細胞[4]。研究顯示，Th17細胞是小鼠對抗真菌感染的免疫基礎，Th17細胞在體內通過Dectin-1受體途徑直接觸發IL-17抵抗真菌感染[5]。Th1細胞通過觸發炎癥細胞因子IFN-γ、IL-12等，驅動免疫應答，清除真菌病原[6]。但關于Dectin-1受體抗角膜真菌感染的免疫反應具體機制尚不明確。

研究發現，支氣管感染煙曲霉菌Dectin-1-/-小鼠與支氣管感染煙曲霉菌野生小鼠比較，肺部病原負荷相對更重，聚集到感染部位的單核巨噬細胞、中性粒細胞較支氣管感染煙曲霉菌野生小鼠組明顯減少，相關炎癥細胞因子的表達量及生存率明顯降低，ROS反應的觸發受到抑制[7]。筆者發現，通過體外模擬活化巨噬細胞真菌性角膜炎的過程，用曲霉菌刺激小鼠巨噬細胞激活，隨著感染時間延長，小鼠角膜巨噬細胞表面的Dectin-1受體的mRNA表達水平持續上調，于第9天達高峰，說明在病程早期，真菌表面的β(1,3)-葡聚糖可能驅動Dectin-1信號通路，觸發角膜對真菌的抵御作用，清除病原負荷。因此，筆者推測，Dectin-1受體可能作為一種角膜巨噬細胞模式識別受體，參與活化后巨噬細胞真菌性角膜炎的免疫進程。

Saijo等發現，雖然Dectin-1信號通路同時誘導Th17和Th1細胞分化，但是優先驅動Th17細胞分化[8]。支氣管煙曲霉菌感染Dectin-1-/-小鼠與煙曲霉菌支氣管感染野生型小鼠相比，IL-17表達下調、IL-23表達增加，病原負荷更重，Th1細胞免疫通過產生IL-12 p40 IFN-γ發揮主導作用[9]。筆者的研究也發現，感染后第1,3,5,7,9天實驗組IL-17、IL-12基因mRNA的表達顯著高于對照組。第3,5,7天IL-17基因mRNA的表達高于IL-12基因mRNA的表達。筆者推測，Dectin-1信號通路可能直接誘導獲得性免疫，包括Th1和Th17細胞，上調IL-17、IL-12的表達，構成了角膜清除真菌的免疫防線。

研究表明，正常角膜中不存在CD4+細胞，Th17在抗真菌感染中具有保護性作用。Huang等報道，IL17受體基因缺失小鼠與野生型小鼠相比，腎部感染第3天念珠菌負荷明顯增加，清除病原能力、生存率顯著降低[10]。這與本實驗組角膜真菌負荷減輕表現一致。筆者推測，Dectin-1的信號通路優先觸發Th17細胞分化，Th17細胞的激活具有保護性作用，在清除真菌病原中發揮重要作用。

小鼠角膜炎中有效的抗真菌免疫應答，需要Th17/Th1細胞免疫應答相互平衡。受真菌感染后，Th1細胞通過誘導IL-12及IFN-γ等介導免疫應答。由單核巨噬細胞分泌的IL-12是Th1型細胞的主要激動劑，進一步觸發Th1型細胞分化，持續上調IL-12、IFN-γ等。但是，Th1細胞免疫應答通路中的IFN-γ將抑制Th17細胞分化[11]。筆者推測，在本研究中，角膜感染第7天，實驗組IL-17和IL-12表達總量達到高峰，角膜中央潰瘍、明顯有水腫，伴壞死病灶或穿孔炎癥反應劇烈。對照組Th1細胞免疫發揮主導作用，IFN-γ抑制Th17細胞分化，清除病原負荷，角膜中央輕度水腫伴灰白色混濁，廣泛分布新生血管，炎癥損害相對較輕。若降低Dectin-1的表達水平，能否減輕炎癥損傷組織的作用及Dectin-1的表達與Th1、Th17之間的相互關系，有待進一步研究。

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(編輯:張慧茹)

The Expression of Dectin-1 Receptor, Interleukin-17 and Interleukin-12 in Mice Fungal Keratitis after the Activation of Macrophage

DONG Chenghuan， ZHENG Xiaoqian， XU Guoxing

Department of Optometry & Ophthalmology, School of Medical Technology and Engineering, Fujian Medical University,Fuzhou 350005, China

ObjectiveTo investigate expression level of c-type lectin-1 receptor (dectin-1), interleukin-17(IL-17) and interleukin-12 (IL-12) in mice afflicted with fungal keratitis after the activation of macrophages.MethodsPrior to the infection ofFusariumsolani, BALB/c mice received subconjunctival injection of latex beads or liposomes containing phosphate-buffered saline (PBS-LIP) in the corneas to establish the experimental group or the control group, respectively.After infection, the morphological features of fungal keratitis were examined under the slit-lamp and microscope at day 1, 3, 5, 7, 9 and the histopathological changes were analyzed by H-E staining.The cytokine mRNA levels of IL-12, IL-17, and dectin-1 in the cornea were measured by real-time PCR.ResultsThe experimental group presented heavy inflammation, diffuse opacity, zero neovascularization, and corneal perforation at day 7; the control group showed diffuse opacity, extensive neovascularization at day 5, but no corneal perforation.Histopathologic examination of corneas found in the experimental group marked dense inflammatory cell infiltration and damage of the corneal stroma at day 5; The mRNA expressions of dectin-1, IL-17, and IL-12 in the experimental group were markedly enhanced at day 3,5,7,9 when compared with those in the control group.ConclusionDectin-1, IL-17, and IL-12 may play an important role in host defense against corneal infection ofF.solani.

keratitis； eye infections, fungal； macrophages； agglutinins； Th1 cells/immunology； T-lymphocytes； interleukins

2015-07-06

福建省教育廳科技項目(JA14136)

福建醫科大學 醫學技術與工程學院眼視光學系，福州350005

董騁寰(1986-)，女，醫學碩士

徐國興. Email：fjmuxuguoxing@hotmail.com

R329.24； R331.125； R392； R392.12； R519； R772.21

A

1672-4194(2016)02-0103-04