氯胺酮誘導發育期大鼠神經細胞凋亡時神經甾體17β雌二醇水平的變化

李建立， 崔紅賞， 郭洪霞， 于　洋， 吳紅海， 侯艷寧

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氯胺酮誘導發育期大鼠神經細胞凋亡時神經甾體17β雌二醇水平的變化

李建立1， 崔紅賞2， 郭洪霞1， 于洋3， 吳紅海3， 侯艷寧3

目的探討連續大劑量應用氯胺酮引起發育期大鼠大腦皮層區神經細胞凋亡時神經甾體17β雌二醇水平的變化及機制。方法30只7日齡雄性SD大鼠，隨機分為對照組和氯胺酮組，每組15只。對照組連續3 d腹腔注射等容量生理鹽水，氯胺酮組連續3 d腹腔注射75 mg/kg氯胺酮，末次注藥后24 h，每組取5只大鼠用免疫組織化學法檢測大腦皮層區cleaved-caspase-3和CYP19A1的表達，其余幼鼠應用高效液相色譜-質譜聯用法(HPLC-MS/MS)測定大腦皮層區神經甾體17β雌二醇的含量。結果與對照組比較，氯胺酮組大鼠大腦皮層區cleaved-caspase-3陽性細胞顯著性增加(P<0.01)，17β雌二醇水平及CYP19A1酶的表達均顯著性下降(P<0.01)。結論連續大劑量應用氯胺酮可引起發育期大鼠大腦皮層區神經細胞凋亡伴隨神經甾體17β雌二醇水平下降，其機制可能與限速酶CYP19A1表達下降有關。

氯胺酮； 雌二醇； 細胞凋亡； 色譜法，高壓液相； 質譜分析法； 基因

氯胺酮作為一種N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受體拮抗劑，廣泛應用于嬰幼兒手術的麻醉。最近動物實驗研究表明，在中樞神經系統的快速發育期反復使用氯胺酮可引起發育期動物大腦廣泛腦區神經細胞凋亡的增加[1-3]。17β雌二醇作為一類神經甾體，對發育期大腦的發育和成熟起著十分重要的作用。研究表明，氯胺酮可引起斑馬魚發育期17β雌二醇水平的下調，導致斑馬魚發育期神經損傷[4-5]。本研究旨在探討氯胺酮引起發育期大鼠大腦皮層區神經細胞凋亡時是否伴隨神經甾體17β雌二醇水平的變化，從神經甾體的角度進一步探討氯胺酮發育期神經毒性的發生機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物與分組母鼠與7日齡雄性幼鼠均為SD大鼠，由河北醫科大學動物實驗中心提供(母鼠及幼鼠動物合格證編號分別為1308067，1306107)。30只幼鼠隨機分為對照組和氯胺酮組，每組15只，對照組連續3 d腹腔注射等容量生理鹽水，氯胺酮組連續3 d腹腔注射75 mg/kg氯胺酮。麻醉后把幼鼠放在暖箱中,給予低流量氧氣(2 L/min)，密切觀察幼鼠的呼吸頻率以及皮膚顏色。各組幼鼠與母鼠的分離時間均為250 min[3]。

1.1.2試劑氯胺酮(福建古田藥業有限公司提供，批號H35020148)，甲睪酮(MT)(中國藥品生物檢定所)，丹酰氯(Sigma-Aldrich公司)，乙酰乙酯、正己烷、甲酸(天津康科德科技有限公司)，cleaved-caspase-3試劑(美國Cell Signaling公司)，CYP19A1試劑(Abcam公司)。

1.1.3主要儀器液質聯用儀(1100LC/MSD，美國Agilent公司)，固相萃取裝置(Visiprep DL，美國Supelco公司)，固相萃取柱(Oasis HLB SPE，美國Waters公司，規格：30 mg/mL，30 μm)，氮氣吹干儀(北京八方世紀公司)。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學染色法檢測大鼠大腦皮層區cleaved-caspase-3和CYP19A1的表達末次給藥后24 h，每組取5只幼鼠給予巴比妥麻醉，斷頭取皮層組織。4%多聚甲醛固定皮層腦組織48 h，用梯度乙醇脫水，石蠟包埋，5 μm厚度切片。切片經二甲苯浸泡3次，梯度乙醇脫水(每次5 min)，自來水浸泡5 min。抗原修復20 min，自然冷卻。滴加3% H2O2去離子水，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次，每次5 min。滴加正常山羊血清工作液，室溫孵育15 min，進行封閉。去除血清，滴加兔抗cleaved-caspase-3(1∶50)和CYP19A1(1∶100)，4 ℃過夜，PBS沖洗3次,每次5 min。滴加生物素化二抗工作液，室溫孵育15 min，PBS沖洗3次,每次5 min。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min，PBS沖洗3次,每次5 min。滴加DAB試劑顯色，顯微鏡下控制顯色時間，自來水沖洗終止反應，常規脫水，中性樹膠封片。

1.2.2神經甾體提取末次給藥后24 h，每組取10只幼鼠給予巴比妥麻醉，斷頭取皮層組織。每100 mg腦組織加入1 mL PBS液勻漿，通過液液萃取的方法提取神經甾體。加入20 μL內標MT(30 ng/mL)，然后加入2 mL乙酸乙酯/正己烷(9∶1)，渦旋混勻5 min，12 000 r/min離心5 min，轉移上層有機相至7 mL玻璃試管中，重復萃取3次，合并有機相，50 ℃水浴N2吹干。然后依次加入10 μL Na2CO3、10 μL丹酰氯(5 mg/mL)、乙腈80 μL，超聲1 min，渦旋1 min，瞬時離心，60 ℃水浴中衍生40 min，衍生反應結束后，12 000 r/min離心10 min，取上清，4 ℃保存待測神經甾體。

1.2.3神經甾體含量測定(1)色譜條件：分析柱為Agilent XDB C18(4.6 mm×50 mm,1.8 μm)；保護柱為Agilent XDB C18(4.6 mm×12 mm)；流動相為A水(含0.1%甲醇)，B甲醇(含0.1%甲醇)，柱溫40 ℃，流速0.5 mL/min；洗劑梯度為0～6.5 min，36%A；6.5～6.6 min，30%A；6.6～17 min，10%A；17～18 min，36%A。進樣量30 μL，每針運行18 min。(2)質譜條件：離子化方式為大氣壓化學離子源；噴霧電壓4 500 V；鞘氣(N2)壓力30 L/min；輔助氣壓力5 L/min；離子傳輸管溫度270 ℃。離子檢測方式：正離子多反應監測，用于定量分析的離子反應分別為(m/z)254.97→(m/z)132.9，158.9(17β雌二醇),(m/z)303.1→(m/z)97.04，109.06(MT)。

2　結　果

2.1氯胺酮對發育期大鼠大腦皮層區cleaved-caspase-3表達的影響與對照組比較，氯胺酮組大鼠大腦皮層區cleaved-caspase-3陽性細胞數/0.01 mm2顯著增加(P<0.01，圖1～2)。

2.2神經甾體的測定17β雌二醇和內標MT的保存時間分別為7.1，6.5 min。標準曲線如下，線性范圍1～200 ng/g，在此范圍內待測物線性關系良好。待測物回收率為(98.8±5)%，日間和日內變異均<12.6%和<9.5%，準確度(相對誤差)<15%。色譜圖見圖3。

Y=0.036 938 9+0.141 111 4×X

R2=0.993 7

W=1/X2

2.3氯胺酮對發育期大鼠皮層區17β雌二醇水平及CYP19A1表達的影響與對照組比較，氯胺酮組大鼠大腦皮層區神經甾體17β雌二醇水平及CYP19A1表達顯著下降(P<0.01，圖4～6)。

3　討　論

氯胺酮作為NMDA受體拮抗藥，動物實驗研究表明，在中樞神經系統快速發育期反復應用氯胺酮可導致大腦神經細胞凋亡，并可能引起動物成年后的學習記憶功能損傷[1-3]。眾多學者對氯胺酮引起發育期大腦神經損傷的機制進行了大量的研究，但其確切機制目前尚不十分清楚[1-3]。以往研究表明，氯胺酮誘導神經元凋亡與引起神經遞質NMDA的受體亞單位NR1的上調有關[6]。神經甾體作為第4代神經遞質，具有催眠鎮靜、抗焦慮、抗驚厥、改善學習記憶功能及神經保護作用。研究表明，在大腦發育和成熟過程，神經甾體水平的下降甚至缺乏會導致神經發育和行為學方面的異常[7]。有研究發現，大腦神經甾體含量變化與帕金森病、阿爾茨海默病、多發性硬化癥、創傷性顱腦損傷等在內的各類疾病有關[8-11]。本研究著重探討氯胺酮引起發育期大鼠大腦神經損傷是否與神經甾體如17β雌二醇的水平變化有關。

雌二醇作為一種內源性神經甾體，在神經元發育過程中發揮著重要的調節作用，促進神經元的存活以及功能維護。張吉強等研究發現，出生后大鼠大腦可表達雌激素合成酶即芳香化酶和雌激素β受體，提示雌激素可能通過其受體對早期神經發育產生調節作用[12]。17β雌二醇可抑制大腦皮層成神經細胞DNA斷裂，抑制神經細胞凋亡，同時誘導成神經細胞的增生和分化，還具有促進神經細胞軸突及樹突的生長，建立和維持突觸功能的作用[13]。有研究表明，抑制膠質細胞膽固醇合成雌二醇的過程，可導致尼曼匹克癥C型的神經退化性改變，而使用17β雌二醇可減輕神經損傷[14]。另有研究表明，NMDA受體拮抗劑MK-801誘導的神經毒性與神經甾體17β雌二醇水平下降有關[15]。以上研究均表明，17β雌二醇對發育期大腦的發育及成熟發揮著重要的調節作用。本研究結果還表明，氯胺酮引起皮層區神經甾體17β雌二醇水平下降，這說明連續大劑量應用氯胺酮引起發育期大鼠皮層區神經細胞凋亡可能與神經甾體17β雌二醇水平下降有關。

在神經甾體的合成通路中，睪酮是雌二醇合成的上游產物，通過CYP19A1酶合成雌二醇[16]。有研究認為，氯胺酮通過抑制CYP19A1酶的基因表達,抑制發育期斑馬魚睪酮向雌二醇的合成，導致神經甾體17β雌二醇水平的明顯下降[4]。在中樞神經系統，通過激活CYP19A1酶的表達可促進17β雌二醇的合成，進而發揮神經保護作用[13]。研究證實，大腦合成神經甾體所需的各類酶主要位于神經元和膠質細胞的線粒體內[17-18]。研究表明，氯胺酮引起發育期大腦損傷與激活線粒體凋亡通路有關[19]。因此推測，氯胺酮可能通過抑制神經甾體17β雌二醇合成限速酶CYP19A1的活性，引起17β雌二醇的合成代謝下降，抑制17β雌二醇對神經元的調節作用，引起神經元功能障礙，最終導致神經元凋亡。

總之，連續大劑量應用氯胺酮可引起發育期大鼠皮層區神經細胞凋亡，凋亡發生可能與氯胺酮抑制皮層區CYP19A1酶的表達導致神經甾體17β雌二醇水平的下降有關。本研究從神經甾體的角度探討了氯胺酮誘導發育期大腦神經損傷的機制，下一步應研究外源性給予17β雌二醇恢復神經甾體17β雌二醇水平是否對氯胺酮引起的發育期大鼠皮層區神經細胞凋亡產生保護作用。

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(編輯:何佳鳳)

Changes in Level of 17β-estradiol when Ketamine Induces Neuroapoptosis in the Developing Rat Brain

LI Jianli1, CUI Hongshang2, GUO Hongxia1, YU Yang3, WU Honghai3, HOU Yanning3

1.Department of Anesthesiology, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, China；2.Department of Thoracic Surgery, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, China；3.Department of Pharmacy, Bethune International Peace Hospital of Chinese PLA, Shijiazhuang 050082, China

ObjectiveTo investigate the effect of ketamine on 17β-estradiol level in the developing rat brain.Methods30 aged 7 days SD male rats were randomly divided into two group: Group C and Group K.Group C was intraperitoneally injected with same volume of saline for three consecutive days, Group K was intraperitoneally injected with 75 mg/kg ketamine for three consecutive days. 24 hours after the last injection, five rats from each group were decapitated under deep anesthesia and the PFC portion was isolated todetect cleaved caspase-3 and CYP19A1 expressions by immunohistochemical analysis (n=5).The PFC of other rats was harvested to determine 17β-estradiol concentration by HPLC-MS/MS assay(n=10).ResultsCompared with the Group C, the expression of cleaved caspase-3 in Group K increased significantly after being treated with 75 mg/kg ketamine for three consecutive days(P<0.01), while 17β-estradiol level and CYP19A1 expression in PFC significantly reduced(P<0.01).ConclusionKetamine can cause decrease in the endogenous 17β-estradiol level, which was associated with the decrease of CYP19A1 expression.

ketamine; estradiol; apoptosis; chromatography, high pressure liquid; mass spectrometry; genes

2015-11-19

河北省衛生廳醫學重點課題(ZL20140095)

1.河北省人民醫院 麻醉科，石家莊050051；

2.河北省人民醫院 胸外科，石家莊050051；

李建立(1976-)，男，副教授，醫學博士

侯艷寧. Email:biph2011@163.com

R322.8； R347.913； R741.02； R971.2； R977.12

A

1672-4194(2016)02-0093-05

3.白求恩國際和平醫院 藥劑科，石家莊050082