APEX1單核苷酸多態性與肝癌易感性關系的研究

鄭智華, 黃愛民, 高美欽, 臧盛兵

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APEX1單核苷酸多態性與肝癌易感性關系的研究

鄭智華1,2, 黃愛民2, 高美欽2, 臧盛兵2

目的探討中國福建人群APEX1單核苷酸多態性(SNP)與肝細胞癌(HCC)易感性的關系。方法應用連接酶檢測反應(LDR)及直接測序法檢測APEX1 rs2307486、rs1130409及rs33956927 3個SNP位點，并進行連鎖不平衡及單倍型分析，探討3個SNP在福建HCC人群中的分布情況，并分析其與該人群HCC易感性的關系。結果相對于GG基因型，rs33956927位點的GA基因型增加了患HCC的風險(P=0.002)，而rs2307486和rs1130409多態性與HCC易感性無關(P>0.05)。結論APEX1 rs33956927多態位點攜帶GA基因型人群可能對HCC更易感，APEX1 rs33956927多態性可作為篩查HCC好發的危險因素；rs2307486和rs1130409多態性與HCC的發生無關。

肝腫瘤； 腫瘤； 基因； 多態性，單核苷酸； 多態現象，遺傳； 聚合酶鏈反應

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是人類最常見的惡性腫瘤之一，其發病率在全世界惡性腫瘤中排名第5位，而死亡率居第3位[1]。中國的新發HCC病例數占全世界所有新發病例數的55%[2-3]。HCC的發生是多因素、多步驟的復雜過程，受環境和遺傳因素影響。而研究發現，基因組內存在的某些單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNP)不僅是遺傳標記，而且可使個體對疾病產生不同的易感性[4-5]。

APEX1基因是多功能的DNA堿基切除修復途徑的限速酶，既具有脫嘌呤/脫嘧啶位點核酸內切酶活性，修復烷化劑、氧自由基、電離輻射等因素產生的DNA損傷，又具調節轉錄因子的DNA結合活性，可通過調節許多轉錄因子的DNA結合活性，參與細胞增殖、分化和細胞凋亡等多種關鍵的細胞反應。分子流行病學研究表明，APEX1多態性與DNA持續交聯、基因型改變和腫瘤危險性直接相關[6-8]。

近年來，APEX1基因多態性與許多惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌、結腸癌和前列腺癌等相關性的研究均見報道[9-11]，而目前國內外對肝癌APEX1多態性的研究未見相關報道。本研究應用多重PCR技術及連接酶檢測反應技術檢測APEX1 3個SNP位點(rs1130409、rs2307486及rs33956927)多態性在福建原發性HCC人群的分布情況，分析其與該人群HCC易感性的關系。

1　材料與方法

1.1材料選取福建醫科大學附屬第一醫院手術切除的新鮮HCC標本100例為病例組，年齡(48.2±11.4)歲(32～72歲)，其中有腫瘤家族史者19例。患者均無其他部位惡性腫瘤史，未接受放療、化學藥物治療。另收集福建醫科大學附屬協和醫院同期來院體檢無腫瘤病史的健康人群血液標本100例為對照組，按照年齡±3歲進行匹配，其中有腫瘤家族史14例。對照組與病例組無血緣關系，均為中國福建地區漢族人群。

1.2方法

1.2.1血液和新鮮組織DNA的抽提按照DNA抽提試劑盒(北京天根生化科技有限公司)的步驟，提取組織DNA，經瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計檢測，-20 ℃凍存備用。

1.2.2PCR擴增目的片段APEX1 rs2307486上下游引物分別為：

F：5′ GCAAACCTGCCACACTCAA3′

R：5′TCGAAGCCCATCCACATT3′

rs1130409上下游引物分別為:

F：5′TATGCTAATTCTGTTTCATTTC3′

R：5′CACCCGGCCTTCCTGATC 3′

rs33956927上下游引物分別為:

F：5′TGTTGGGGTAGAGGTGCCTA3′

R：5′AAAAGAATGCTGGCTTCACG3′

PCR反應體系20 μL PCR，包括Tris-HCl(pH 7.4)10 mmol/L，KCl 50 mmol/L，MgCl22.0 mmol/L，dNTPs 200 mmol/L，Primers 0.5 μmol/L，polymerase 1 U，DNA 2 μL。PCR反應過程包括：95 ℃ 15 min→94 ℃變性30 s→56 ℃退火1 min→72 ℃延伸1 min，共35個循環后，72 ℃延伸7 min。3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察PCR產物的效果。

1.2.3多重連接酶檢測反應各位點探針序列見表1，LDR反應體系包括1×Buffer 1 μL，探針1 μL，連接酶0.05 μL，H2O 16.95 μL，PCR產物1 μL。LDR反應程序為：95 ℃ 2 min→94 ℃ 30 s→50 ℃退火2 min，共35個循環后，72 ℃延伸7 min。取三重LDR產物1 μL，采用5%聚丙烯酰胺凝膠電泳跑膠。采用Genemapper軟件進行基因分型分析，同時樣本送上海生工生物工程公司進行測序分析(各位點基因型測序見圖1～3)。

表1　各位點探針序列

1.3統計學處理所有實驗室基因型數據及調查資料經過核實后，應用EpiData軟件進行數據錄入并建立數據庫，運用SPSS 16.0軟件進行數據整理分析。計算病例組及對照組的基因型、等位基因頻率，使用χ2檢驗比較病例組及對照組間基因型頻率、等位基因頻率的分布差別。采用SHEsis在線軟件計算2個多態性位點間連鎖不平衡系數(D’)和r2值并構建單倍型[12]。采用單因素條件Logistic回歸模型分析基因型與病例組的臨床病例因素的關聯性，計算其OR及95%CI。所有的統計檢驗均為雙側概率檢驗，P<0.05為差別具有統計學意義。

2　結　果

2.1基本信息共收集病例組和對照組各100例，其中男性151例(75.5%)，女性49例(24.5%)。經卡方擬合優度檢驗，病例組和對照組均符合Hardy-Weinberg平衡定律(表2)。病例組和對照組在年齡、性別及民族構成上的比較，差別無統計學意義(P>0.05)；但2組在HBV感染情況分布的比較，差別具有統計學意義(P<0.05)。

2.2rs2307486、rs1130409和rs33956927位點與HCC易感性的關系rs2307486位點等位基因頻率分析見表3，rs1130409位點等位基因頻率分析見表4，各組差別均無統計學意義。在病例組和對照組中，rs33956927等位基因頻率分析P=0.002，基因型頻率P=0.002(表5)。其中T等位基因只在病例組中出現，100例HCC中有9例是GT基因型，其余91例均為GG基因型；對照組中只有GG基因型，未有出現GT基因型。經非條件 logistic 回歸分析法校正HBV感染情況后，與T等位基因相比，G等位基因與HCC的發病風險有統計學意義(P=0.002)。

2.3rs2307486、rs1130409及rs339569273個位點連鎖不平衡及單倍型分析連鎖不平衡分析結果顯示，rs1130409及rs33956927位點間存在連鎖不平衡(D′=0.519)，其余兩兩位點間不存在連鎖不平衡(D′<0.5)。單倍型分析計算，結果顯示所有單倍型均和HCC完全不相關。

表2　各位點病例組和對照組Hardy-Weinberg平衡定律檢驗

表3　rs2307486 基因型頻率統計學分析

表4　rs1130409基因型頻率統計學分析

表5　rs33956927基因型頻率統計學分析

與對照組比較，△:P<0.05.

3　討　論

HCC是最常見的惡性腫瘤之一，惡性度高，預后非常差。福建省作為HCC的高發省份，每年約6 000人因HCC死亡。然而，HCC的發病機制還未完全闡明。研究結果表明，DNA修復基因內的SNP，可影響DNA的修復能力，最終影響HCC的易感性，是HCC的遺傳因素基礎[13]。

APEX1基因位于14號染色體q11.2-12，長度為2.6 kb，有4個內含子和5個外顯子。作為多功能的DNA修復酶，APEX1主要負責修復AP位點，AP位點是DNA最常見的損傷位點之一，具有細胞毒性和基因毒性，若不能修復，可阻礙DNA的復制，導致基因突變、染色體微衛星不穩定性或細胞凋亡，最終可導致腫瘤的發生。此外，APEX1又具有氧化還原因子活性，可通過調節許多轉錄因子的DNA結合活性，參與細胞增殖、分化和細胞凋亡等多種關鍵的細胞反應。本課題組通過組織芯片研究發現，APEX1在HCC的表達明顯高于癌旁肝組織，并且蛋白的細胞質表達增多及細胞核的表達增強，提示肝癌患者的預后越差[14]。本課題組還進一步構建APEX1-siRNA感染肝癌細胞MHCC-97。通過檢測發現，APEX1基因抑制可降低腫瘤的侵襲和運動能力[15],提示肝癌組織中APEX1的檢測可作為判斷患者預后的指標之一，且APEX1有望成為HCC腫瘤治療的靶點。

為進一步研究APEX1 SNP與HCC易感性的關系，筆者檢測rs1130409、rs2307486及rs33956927 3個SNP。rs33956927是APEX1基因核苷酸第2 474位點上G→A的轉換，使第241個氨基酸由甘氨酸轉換成精氨酸，位于第5個外顯子上。本研究中，筆者檢測100例福建省HCC患者的DNA，發現rs33956927 A等位基因頻率為0.045，而正常對照人群中未發現T等位基因。正常人群中均為純合子GG，而HCC患者只有純合子GG或雜合子GA，沒有AA基因型。GG基因型與GA基因型分布具有顯著差別，提示rs33956927位點的GA基因型相對于GG基因型，增加了患HCC風險(P=0.002)，攜帶GA基因型人群可能對HCC更易感。由于rs33956927是APEX1 4個錯義突變位點之一，筆者推測，可能是SNP造成蛋白質構象發生改變，從而使基因功能受到影響。但具體機制尚需進一步實驗深入研究。

rs1130409是目前APEX1研究最多的SNP位點，它指在核苷酸第2 197位點上T→G的顛換，使第148個氨基酸由天冬氨酸轉換成谷氨酸，位于第5個外顯子上，DNA修復功能結構域內。該位點可出現3種基因型：TT、GT和GG。國內外有關APEX1 rs1130409多態性與腫瘤相關性的研究結果的報道不盡一致。148Glu/Glu基因型在德國人群中具有保護性意義，可降低肺癌的危險性[16]。而其他研究結果卻顯示，148Glu/Glu基因型可增加某些腫瘤易感性[9]。但Ito等研究發現，日本人群rs1130409多態性與肺癌易感性無關，Asp/Glu和Glu/Glu基因型與Asp/Asp基因型比較，其肺癌危險性差別無統計學意義[17]。對于國內外研究結果不盡一致的現象，筆者推測可能是由于環境致癌物暴露及程度的不同以及基因型頻率分布的種族和地區差別所致。雖然有研究指出，rs1130409多態性并不影響APEX1的功能，包括核酸內切酶活性和DNA結合能力，不會使DNA修復功能發生變化，但該多態性可能會影響細胞的某些正常生理進程[18]。例如，Hu等發現，rs1130409多態性在正常人群中與有絲分裂延遲有關，且148Glu等位基因型可能對電離輻射具有更高的敏感性，從而增加對腫瘤的易感性[19]。這也可以解釋rs1130409多態性增加腫瘤易感性的結論。

本研究結果顯示，rs1130409G等位基因頻率為0.396，但rs1130409基因型及等位基因分布無顯著差別，提示rs1130409多態性與福建省HCC的危險性無關(P=0.680)。

APEX1 rs2307486位于第3外顯子上，是第1 247個堿基由A轉換成G，導致該位點形成氨基酸變異體，由異亮氨酸轉變成纈氨酸。目前國內外對該SNP的研究報道并不多，僅Zienolddiny等檢測其在肺癌人群的分布，發現rs2307486多態性具有保護作用，可降低挪威人群非小細胞肺癌的危險性[20]。本研究中，正常人群和肝癌HCC只有純合子AA或雜合子AG，沒有GG基因型，但統計學分析顯示，正常人群和HCC患者中基因型及等位基因分布的差別無統計學意義(P>0.05)，提示rs2307486多態性與HCC發生的危險性無關。

本研究發現，rs1130409與rs33956927位點間存在著連鎖不平衡(D′=0.519)，但二者之間的關聯較弱(D′<0.8)。3個多態性位點共構建了7種單倍型，頻率<0.05的單倍型被忽略，只計算P>0.05的單倍型，結果顯示所有單倍型和HCC均不相關。

總之，本研究發現在福建人群中，APEX1 rs33956927多態性位點GA基因型可增加患HCC的風險，但未發現rs1130409和rs2307486多態性與肝癌的易感性相關。rs1130409與rs33956927位點間存在著連鎖不平衡，但是本研究尚未確定這2個位點聯合作用是否對APEX1基因功能產生影響。要解決上述問題，需進一步擴大樣本量，并進行基因功能機制的研究來探討APEX1多態性與HCC的關系。

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(編輯:張慧茹)

Association of Single Nucleotide Polymorphism of APEX1 Gene with Susceptibility to Hepatocellular Carcinoma

ZHENG Zhihua1,2， HUANG Aimin2， GAO Meiqin2， ZANG Shengbing2

1. Department of Pathology, Quanzhou Medical College, Quanzhou 362000, China;2. Department of Pathology, Institution of Oncology, Fujian Medical University, Fuzhou 350004, China

ObjectiveTo explore the association between the single nucleotide polymorphisms(SNP) of APEX1 gene and the susceptibility to hepatocellular carcinoma among Chinese Han people in Fujian.MethodsThe SNP of APEX1 rs2307486, rs1130409 and rs33956927 were detected by ligase detection reaction (LDR) and sequecing test, and the linkage disequilibrium (LD) and haplotype analysis were also used to investigate the association of the SNPs with the risk of HCC.ResultsFor the polymorphism of rs33956927 significantly increased the risk of develop HCC(P=0.002), whereas the rs2307486 and rs1130409 polymorphisms had no effects on HCC(P>0.05).ConclusionsAPEX1 rs33956927 polymorphism with GA genotype may more sensitive to HCC.APEX1 rs33956927 polymorphism can be used as a risk factor for screening HCC; while rs2307486 and rs1130409 polymorphisms had no effects on HCC.

liver neoplasms； neoplasms； genes； polymorphism, single nucleotide； polymorphism, genetic； polymerase chain reaction

2015-12-22

福建省自然科學基金(2006J0099)

1. 泉州醫學高等專科學校 基礎醫學部病理教研室，泉州362000;

2. 福建醫科大學 基礎醫學院病理學系，福州350004

鄭智華(1980-)，女，講師，醫學碩士

黃愛民. Email: aimin@fjmu.edu.cn

R394； R394.2； R394.25； R735.7

A

1672-4194(2016)02-0088-05