APEX1單核苷酸多態(tài)性與肝癌易感性關(guān)系的研究

鄭智華, 黃愛民, 高美欽, 臧盛兵

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APEX1單核苷酸多態(tài)性與肝癌易感性關(guān)系的研究

鄭智華1,2, 黃愛民2, 高美欽2, 臧盛兵2

目的探討中國福建人群APEX1單核苷酸多態(tài)性(SNP)與肝細胞癌(HCC)易感性的關(guān)系。方法應(yīng)用連接酶檢測反應(yīng)(LDR)及直接測序法檢測APEX1 rs2307486、rs1130409及rs33956927 3個SNP位點，并進行連鎖不平衡及單倍型分析，探討3個SNP在福建HCC人群中的分布情況，并分析其與該人群HCC易感性的關(guān)系。結(jié)果相對于GG基因型，rs33956927位點的GA基因型增加了患HCC的風險(P=0.002)，而rs2307486和rs1130409多態(tài)性與HCC易感性無關(guān)(P>0.05)。結(jié)論APEX1 rs33956927多態(tài)位點攜帶GA基因型人群可能對HCC更易感，APEX1 rs33956927多態(tài)性可作為篩查HCC好發(fā)的危險因素；rs2307486和rs1130409多態(tài)性與HCC的發(fā)生無關(guān)。

肝腫瘤； 腫瘤； 基因； 多態(tài)性，單核苷酸； 多態(tài)現(xiàn)象，遺傳； 聚合酶鏈反應(yīng)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是人類最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全世界惡性腫瘤中排名第5位，而死亡率居第3位[1]。中國的新發(fā)HCC病例數(shù)占全世界所有新發(fā)病例數(shù)的55%[2-3]。HCC的發(fā)生是多因素、多步驟的復(fù)雜過程，受環(huán)境和遺傳因素影響。而研究發(fā)現(xiàn)，基因組內(nèi)存在的某些單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)不僅是遺傳標記，而且可使個體對疾病產(chǎn)生不同的易感性[4-5]。

APEX1基因是多功能的DNA堿基切除修復(fù)途徑的限速酶，既具有脫嘌呤/脫嘧啶位點核酸內(nèi)切酶活性，修復(fù)烷化劑、氧自由基、電離輻射等因素產(chǎn)生的DNA損傷，又具調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性，可通過調(diào)節(jié)許多轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性，參與細胞增殖、分化和細胞凋亡等多種關(guān)鍵的細胞反應(yīng)。分子流行病學研究表明，APEX1多態(tài)性與DNA持續(xù)交聯(lián)、基因型改變和腫瘤危險性直接相關(guān)[6-8]。

近年來，APEX1基因多態(tài)性與許多惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌等相關(guān)性的研究均見報道[9-11]，而目前國內(nèi)外對肝癌APEX1多態(tài)性的研究未見相關(guān)報道。本研究應(yīng)用多重PCR技術(shù)及連接酶檢測反應(yīng)技術(shù)檢測APEX1 3個SNP位點(rs1130409、rs2307486及rs33956927)多態(tài)性在福建原發(fā)性HCC人群的分布情況，分析其與該人群HCC易感性的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1材料選取福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除的新鮮HCC標本100例為病例組，年齡(48.2±11.4)歲(32～72歲)，其中有腫瘤家族史者19例。患者均無其他部位惡性腫瘤史，未接受放療、化學藥物治療。另收集福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院同期來院體檢無腫瘤病史的健康人群血液標本100例為對照組，按照年齡±3歲進行匹配，其中有腫瘤家族史14例。對照組與病例組無血緣關(guān)系，均為中國福建地區(qū)漢族人群。

1.2方法

1.2.1血液和新鮮組織DNA的抽提按照DNA抽提試劑盒(北京天根生化科技有限公司)的步驟，提取組織DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計檢測，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PCR擴增目的片段APEX1 rs2307486上下游引物分別為：

F：5′ GCAAACCTGCCACACTCAA3′

R：5′TCGAAGCCCATCCACATT3′

rs1130409上下游引物分別為:

F：5′TATGCTAATTCTGTTTCATTTC3′

R：5′CACCCGGCCTTCCTGATC 3′

rs33956927上下游引物分別為:

F：5′TGTTGGGGTAGAGGTGCCTA3′

R：5′AAAAGAATGCTGGCTTCACG3′

PCR反應(yīng)體系20 μL PCR，包括Tris-HCl(pH 7.4)10 mmol/L，KCl 50 mmol/L，MgCl22.0 mmol/L，dNTPs 200 mmol/L，Primers 0.5 μmol/L，polymerase 1 U，DNA 2 μL。PCR反應(yīng)過程包括：95 ℃ 15 min→94 ℃變性30 s→56 ℃退火1 min→72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)后，72 ℃延伸7 min。3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察PCR產(chǎn)物的效果。

1.2.3多重連接酶檢測反應(yīng)各位點探針序列見表1，LDR反應(yīng)體系包括1×Buffer 1 μL，探針1 μL，連接酶0.05 μL，H2O 16.95 μL，PCR產(chǎn)物1 μL。LDR反應(yīng)程序為：95 ℃ 2 min→94 ℃ 30 s→50 ℃退火2 min，共35個循環(huán)后，72 ℃延伸7 min。取三重LDR產(chǎn)物1 μL，采用5%聚丙烯酰胺凝膠電泳跑膠。采用Genemapper軟件進行基因分型分析，同時樣本送上海生工生物工程公司進行測序分析(各位點基因型測序見圖1～3)。

表1　各位點探針序列

1.3統(tǒng)計學處理所有實驗室基因型數(shù)據(jù)及調(diào)查資料經(jīng)過核實后，應(yīng)用EpiData軟件進行數(shù)據(jù)錄入并建立數(shù)據(jù)庫，運用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)整理分析。計算病例組及對照組的基因型、等位基因頻率，使用χ2檢驗比較病例組及對照組間基因型頻率、等位基因頻率的分布差別。采用SHEsis在線軟件計算2個多態(tài)性位點間連鎖不平衡系數(shù)(D’)和r2值并構(gòu)建單倍型[12]。采用單因素條件Logistic回歸模型分析基因型與病例組的臨床病例因素的關(guān)聯(lián)性，計算其OR及95%CI。所有的統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)概率檢驗，P<0.05為差別具有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)　果

2.1基本信息共收集病例組和對照組各100例，其中男性151例(75.5%)，女性49例(24.5%)。經(jīng)卡方擬合優(yōu)度檢驗，病例組和對照組均符合Hardy-Weinberg平衡定律(表2)。病例組和對照組在年齡、性別及民族構(gòu)成上的比較，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；但2組在HBV感染情況分布的比較，差別具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2rs2307486、rs1130409和rs33956927位點與HCC易感性的關(guān)系rs2307486位點等位基因頻率分析見表3，rs1130409位點等位基因頻率分析見表4，各組差別均無統(tǒng)計學意義。在病例組和對照組中，rs33956927等位基因頻率分析P=0.002，基因型頻率P=0.002(表5)。其中T等位基因只在病例組中出現(xiàn)，100例HCC中有9例是GT基因型，其余91例均為GG基因型；對照組中只有GG基因型，未有出現(xiàn)GT基因型。經(jīng)非條件 logistic 回歸分析法校正HBV感染情況后，與T等位基因相比，G等位基因與HCC的發(fā)病風險有統(tǒng)計學意義(P=0.002)。

2.3rs2307486、rs1130409及rs339569273個位點連鎖不平衡及單倍型分析連鎖不平衡分析結(jié)果顯示，rs1130409及rs33956927位點間存在連鎖不平衡(D′=0.519)，其余兩兩位點間不存在連鎖不平衡(D′<0.5)。單倍型分析計算，結(jié)果顯示所有單倍型均和HCC完全不相關(guān)。

表2　各位點病例組和對照組Hardy-Weinberg平衡定律檢驗

表3　rs2307486 基因型頻率統(tǒng)計學分析

表4　rs1130409基因型頻率統(tǒng)計學分析

表5　rs33956927基因型頻率統(tǒng)計學分析

與對照組比較，△:P<0.05.

3　討　論

HCC是最常見的惡性腫瘤之一，惡性度高，預(yù)后非常差。福建省作為HCC的高發(fā)省份，每年約6 000人因HCC死亡。然而，HCC的發(fā)病機制還未完全闡明。研究結(jié)果表明，DNA修復(fù)基因內(nèi)的SNP，可影響DNA的修復(fù)能力，最終影響HCC的易感性，是HCC的遺傳因素基礎(chǔ)[13]。

APEX1基因位于14號染色體q11.2-12，長度為2.6 kb，有4個內(nèi)含子和5個外顯子。作為多功能的DNA修復(fù)酶，APEX1主要負責修復(fù)AP位點，AP位點是DNA最常見的損傷位點之一，具有細胞毒性和基因毒性，若不能修復(fù)，可阻礙DNA的復(fù)制，導(dǎo)致基因突變、染色體微衛(wèi)星不穩(wěn)定性或細胞凋亡，最終可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。此外，APEX1又具有氧化還原因子活性，可通過調(diào)節(jié)許多轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性，參與細胞增殖、分化和細胞凋亡等多種關(guān)鍵的細胞反應(yīng)。本課題組通過組織芯片研究發(fā)現(xiàn)，APEX1在HCC的表達明顯高于癌旁肝組織，并且蛋白的細胞質(zhì)表達增多及細胞核的表達增強，提示肝癌患者的預(yù)后越差[14]。本課題組還進一步構(gòu)建APEX1-siRNA感染肝癌細胞MHCC-97。通過檢測發(fā)現(xiàn)，APEX1基因抑制可降低腫瘤的侵襲和運動能力[15],提示肝癌組織中APEX1的檢測可作為判斷患者預(yù)后的指標之一，且APEX1有望成為HCC腫瘤治療的靶點。

為進一步研究APEX1 SNP與HCC易感性的關(guān)系，筆者檢測rs1130409、rs2307486及rs33956927 3個SNP。rs33956927是APEX1基因核苷酸第2 474位點上G→A的轉(zhuǎn)換，使第241個氨基酸由甘氨酸轉(zhuǎn)換成精氨酸，位于第5個外顯子上。本研究中，筆者檢測100例福建省HCC患者的DNA，發(fā)現(xiàn)rs33956927 A等位基因頻率為0.045，而正常對照人群中未發(fā)現(xiàn)T等位基因。正常人群中均為純合子GG，而HCC患者只有純合子GG或雜合子GA，沒有AA基因型。GG基因型與GA基因型分布具有顯著差別，提示rs33956927位點的GA基因型相對于GG基因型，增加了患HCC風險(P=0.002)，攜帶GA基因型人群可能對HCC更易感。由于rs33956927是APEX1 4個錯義突變位點之一，筆者推測，可能是SNP造成蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，從而使基因功能受到影響。但具體機制尚需進一步實驗深入研究。

rs1130409是目前APEX1研究最多的SNP位點，它指在核苷酸第2 197位點上T→G的顛換，使第148個氨基酸由天冬氨酸轉(zhuǎn)換成谷氨酸，位于第5個外顯子上，DNA修復(fù)功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)。該位點可出現(xiàn)3種基因型：TT、GT和GG。國內(nèi)外有關(guān)APEX1 rs1130409多態(tài)性與腫瘤相關(guān)性的研究結(jié)果的報道不盡一致。148Glu/Glu基因型在德國人群中具有保護性意義，可降低肺癌的危險性[16]。而其他研究結(jié)果卻顯示，148Glu/Glu基因型可增加某些腫瘤易感性[9]。但Ito等研究發(fā)現(xiàn)，日本人群rs1130409多態(tài)性與肺癌易感性無關(guān)，Asp/Glu和Glu/Glu基因型與Asp/Asp基因型比較，其肺癌危險性差別無統(tǒng)計學意義[17]。對于國內(nèi)外研究結(jié)果不盡一致的現(xiàn)象，筆者推測可能是由于環(huán)境致癌物暴露及程度的不同以及基因型頻率分布的種族和地區(qū)差別所致。雖然有研究指出，rs1130409多態(tài)性并不影響APEX1的功能，包括核酸內(nèi)切酶活性和DNA結(jié)合能力，不會使DNA修復(fù)功能發(fā)生變化，但該多態(tài)性可能會影響細胞的某些正常生理進程[18]。例如，Hu等發(fā)現(xiàn)，rs1130409多態(tài)性在正常人群中與有絲分裂延遲有關(guān)，且148Glu等位基因型可能對電離輻射具有更高的敏感性，從而增加對腫瘤的易感性[19]。這也可以解釋rs1130409多態(tài)性增加腫瘤易感性的結(jié)論。

本研究結(jié)果顯示，rs1130409G等位基因頻率為0.396，但rs1130409基因型及等位基因分布無顯著差別，提示rs1130409多態(tài)性與福建省HCC的危險性無關(guān)(P=0.680)。

APEX1 rs2307486位于第3外顯子上，是第1 247個堿基由A轉(zhuǎn)換成G，導(dǎo)致該位點形成氨基酸變異體，由異亮氨酸轉(zhuǎn)變成纈氨酸。目前國內(nèi)外對該SNP的研究報道并不多，僅Zienolddiny等檢測其在肺癌人群的分布，發(fā)現(xiàn)rs2307486多態(tài)性具有保護作用，可降低挪威人群非小細胞肺癌的危險性[20]。本研究中，正常人群和肝癌HCC只有純合子AA或雜合子AG，沒有GG基因型，但統(tǒng)計學分析顯示，正常人群和HCC患者中基因型及等位基因分布的差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示rs2307486多態(tài)性與HCC發(fā)生的危險性無關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，rs1130409與rs33956927位點間存在著連鎖不平衡(D′=0.519)，但二者之間的關(guān)聯(lián)較弱(D′<0.8)。3個多態(tài)性位點共構(gòu)建了7種單倍型，頻率<0.05的單倍型被忽略，只計算P>0.05的單倍型，結(jié)果顯示所有單倍型和HCC均不相關(guān)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)在福建人群中，APEX1 rs33956927多態(tài)性位點GA基因型可增加患HCC的風險，但未發(fā)現(xiàn)rs1130409和rs2307486多態(tài)性與肝癌的易感性相關(guān)。rs1130409與rs33956927位點間存在著連鎖不平衡，但是本研究尚未確定這2個位點聯(lián)合作用是否對APEX1基因功能產(chǎn)生影響。要解決上述問題，需進一步擴大樣本量，并進行基因功能機制的研究來探討APEX1多態(tài)性與HCC的關(guān)系。

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(編輯:張慧茹)

Association of Single Nucleotide Polymorphism of APEX1 Gene with Susceptibility to Hepatocellular Carcinoma

ZHENG Zhihua1,2， HUANG Aimin2， GAO Meiqin2， ZANG Shengbing2

1. Department of Pathology, Quanzhou Medical College, Quanzhou 362000, China;2. Department of Pathology, Institution of Oncology, Fujian Medical University, Fuzhou 350004, China

ObjectiveTo explore the association between the single nucleotide polymorphisms(SNP) of APEX1 gene and the susceptibility to hepatocellular carcinoma among Chinese Han people in Fujian.MethodsThe SNP of APEX1 rs2307486, rs1130409 and rs33956927 were detected by ligase detection reaction (LDR) and sequecing test, and the linkage disequilibrium (LD) and haplotype analysis were also used to investigate the association of the SNPs with the risk of HCC.ResultsFor the polymorphism of rs33956927 significantly increased the risk of develop HCC(P=0.002), whereas the rs2307486 and rs1130409 polymorphisms had no effects on HCC(P>0.05).ConclusionsAPEX1 rs33956927 polymorphism with GA genotype may more sensitive to HCC.APEX1 rs33956927 polymorphism can be used as a risk factor for screening HCC; while rs2307486 and rs1130409 polymorphisms had no effects on HCC.

liver neoplasms； neoplasms； genes； polymorphism, single nucleotide； polymorphism, genetic； polymerase chain reaction

2015-12-22

福建省自然科學基金(2006J0099)

1. 泉州醫(yī)學高等專科學校 基礎(chǔ)醫(yī)學部病理教研室，泉州362000;

2. 福建醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院病理學系，福州350004

鄭智華(1980-)，女，講師，醫(yī)學碩士

黃愛民. Email: aimin@fjmu.edu.cn

R394； R394.2； R394.25； R735.7

A

1672-4194(2016)02-0088-05