N-乙酰半胱氨酸通過抑制HIF-1α下調肝癌HepG2細胞survivin和VEGF表達的實驗研究*

王濤　溫桂海　張桂東　李恩君　武向鵬　苑昭獎　王杰

(1.邯鄲市中心醫院普外一科，河北 邯鄲 056001;2.重慶市中醫院呼吸內科，重慶 400011)

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N-乙酰半胱氨酸通過抑制HIF-1α下調肝癌HepG2細胞survivin和VEGF表達的實驗研究*

王濤1溫桂海1張桂東1李恩君1武向鵬1苑昭獎1王杰2

(1.邯鄲市中心醫院普外一科，河北 邯鄲 056001;2.重慶市中醫院呼吸內科，重慶 400011)

【摘要】目的探討在低氧環境下N-乙酰半胱氨酸(NAC)能否通過抑制HIF-1α合成下調肝癌HepG2細胞survivin和VEGF的表達。方法將肝癌HepG2細胞分為3組，分別為常氧組(Normoxia組)、低氧組(Hypoxia組)和NAC+低氧組(NAC+Hypoxia組)。在低氧環境下對肝癌HepG2細胞使用NAC進行干預，在不同時間點(0h、24h和72h)采用MTT法對HepG2細胞的活性進行檢測；同時在干預24h后，使用qPCR法和western blot法對HepG2細胞survivin、VEGF和HIF-1α的mRNA和蛋白水平進行檢測。結果低氧環境下肝癌HepG2細胞活性呈時間依賴性下降，差異有統計學意義(P<0.05)；且在各時間點與低氧組細胞相比較NAC+低氧組細胞活性下降更加顯著，差異有統計學意義(P<0.05)。在低氧環境下24h后HepG2細胞survivin、VEGF和HIF-1α mRNA和蛋白表達較常氧環境下顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)；但NAC+低氧組細胞survivin、VEGF和HIF-1α mRNA和蛋白的表達水平較低氧組細胞顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)。結論低氧環境中N-乙酰半胱氨酸(NAC)可以通過下調HIF-1α的合成抑制肝癌HepG2細胞survivin、VEGF的表達，并可有效抑制腫瘤細胞的增殖。該基礎研究為NAC應用于腫瘤的臨床治療奠定了一定的理論基礎。

【關鍵詞】N-乙酰半胱氨酸；缺氧誘導因子-1α；survivin；血管內皮生長因子；HepG2細胞

由于腫瘤細胞增殖、分化和生長的無序性和腫瘤血管生成的異常，導致腫瘤特別是實體腫瘤組織內部出現不同程度的缺氧[1-5]。目前大量基礎研究發現低氧(hypoxia)或者缺氧環境可成為誘導和促進腫瘤演進的重要因素[1-6]。并有研究認為缺氧相關的組織微環境在包括肝癌、非小細胞肺癌及直結腸癌等多種腫瘤細胞的增殖(proliferation)、侵襲(invasion)、分化(differentiation)、轉移(metastasis)和腫瘤血管生成(angiogenesis)的過程中扮演著重要的角色[1-6]。同時進一步的實驗發現缺氧誘導因子-1α (hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)對缺氧環境中的腫瘤細胞的生物學特性具有重要的調控作用[1-6]。多個研究表明抑制HIF-1α的表達或活化可以有效抑制多種腫瘤的血管生成和腫瘤細胞的增殖[1-6]。目前實驗發現N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)對結腸癌等多種實體腫瘤細胞的增殖有顯著的抑制作用，并認為與抑制HIF-1α的表達密切相關[7]。本研究的目的是探討在低氧環境下NAC對于肝癌HepG2細胞的抑制作用及其潛在的分子機制。

1材料和方法

1.1主要試劑和材料RNA提取試劑盒和qPCR試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；鼠抗人survivin抗體、鼠抗人VEGF抗體、鼠抗人HIF-1α抗體和鼠抗人β-actin抗體均購自美國Santa Cruz公司；N-乙酰半胱氨酸購自美國Sigma公司；DMEM培養基購自美國Gibco公司；小牛血清購自澳大利亞Gibco公司；MTT試劑盒購自美國Promega公司；其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1細胞培養肝癌HepG2細胞常規接種在含10%胎牛血清、100g/L 青霉素、100g/L鏈霉素的DMEM培養液中，置于37℃、95%空氣、5% CO2孵箱內培養。每48 h換液、傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。HepG2細胞分為常氧組(Normoxia組)、低氧組(Hypoxia組)和低氧+N-乙酰半胱氨酸組(Hypoxia+NAC組)。其中常氧組和低氧組細胞加入PBS，NAC+低氧組加入溶于0.5% DMSO終濃度為40mM的N-乙酰半胱氨酸溶液，而后將低氧組和NAC+低氧組細胞移置于低氧環境(1% O2、5% CO2和94% N2)進行培養。

1.2.2細胞活性檢測取對數生長期細胞消化制成單細胞懸液，接種于96孔培養板中，每孔接種100μl約含5×103個細胞。使用MTT比色試驗對NAC干預后不同時間點(0h、24h和72h)的細胞生長狀態進行測定，實驗重復4次。細胞活性(%) = (OD樣本/OD 常氧組0h) × 100 (%)[8]。

1.2.3qPCR法檢測細胞中survivin、VEGF和HIF-1α mRNA表達檢測干預24h后，按照qPCR試劑盒說明書提取細胞總RNA。引物：survivin正義5′-CATGGG TGCCC CGACGTTG-3′，反義5′-GCTC CGGCCAGAGGC CTCAA-3′；VEGF正義5′-TACCTCC ACCATGCCAA GTG-3′，反義5′-ATGATT CTGCCCTC CTCCTTC-3′；HIF-1α正義 5′-CGTTC CTTCGATCA GTTGTC-3′，反義5′-TCAGT GGTGGCA GTGGTAGT-3′；β-actin正義：5′-CATGTAC GTTGCTAT CCAGGC-3′，反義：5′-CTCCTTAATG TCACGCACGAT-3′。按照試劑盒說明書介紹進行反轉錄和擴增實驗。使用2-ΔΔCt法對survivin、VEGF和HIF-1α mRNA表達水平進行測定，ΔΔCt = (Ct,目標-Ct,β-actin)干預組-(Ct,目標-Ct,β-actin)對照組[9]。

1.2.4Western blot法檢測細胞中survivin、VEGF和HIF-1α蛋白表達干預24h后，按照試劑盒操作要求，首先提取細胞總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1 h，分別加入鼠抗人單克隆抗體survivin(1∶1000)、VEGF (1∶1000)、HIF-1α (1∶1000)和β-actin (1∶1200)，4℃孵育過夜，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2000)，用ECL進行顯色，用凝膠成像分析系統進行掃描。

1.3統計學分析采用SPSS17.0進行單因素方差分析，兩樣本均數多重比較采用LSD法，計量資料以均數±標準差表示。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1細胞活性測定比較在低氧環境中，肝癌HepG2細胞活性隨時間延長而逐漸下降，差異均有顯著統計學意義(P<0.05)；且在對應時間點與低氧組相比較，NAC+低氧組細胞活性下降更加顯著，差異均有顯著統計學意義(P<0.05)，見表1。

Table 1Cell viability of HepG2 cells at different time points (0 h,24h,and 72h)

分組 0h24h72hNAC+低氧組101.2±4.262.7±14.5①38.4±16.9①低氧組98.7±3.781.6±8.274.3±11.2

注：與對應時間點低氧組相比較①P<0.05

2.2survivin mRNA和蛋白的表達在干預24h后，低氧環境下HepG2細胞survivin mRNA和蛋白表達較常氧環境下顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)；同時與低氧組比較，NAC+低氧組細胞survivin mRNA和蛋白表達相對更低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2和圖1。

2.3VEGF mRNA和蛋白的表達在干預24h后，低氧環境下HepG2細胞VEGF mRNA和蛋白表達較常氧環境下顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)；同時與低氧組比較，NAC+低氧組細胞VEGFmRNA和蛋白表達相對更低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3和圖2。

表2　肝癌HepG2細胞survivin mRNA的表達

注：與常氧組相比較，①P<0.05，②與低氧組相比較P<0.05

圖1　肝癌HepG2細胞survivin表達的western blot結果

注：與常氧組相比較①P<0.05，與低氧組相比較②P<0.05

2.4HIF-1α mRNA和蛋白的表達在干預24h后，低氧環境下HepG2細胞HIF-1α mRNA和蛋白表達較常氧環境下明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與低氧組比較，NAC+低氧組細胞HIF-1α mRNA和蛋白表達相對更低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3和圖2。

圖2肝癌HepG2細胞VEGF和HIF-1α表達的western blot結果

Figure 2Western blot results of VEGF and HIF-1α in liver cancer HepG2 cells

3討論

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的肝膽系統惡性腫瘤，流行病學調查顯示在人類最常見的惡性腫瘤中肝細胞癌位居第五位，統計顯示每年的新發病例數男性約為52.3萬(占男性惡性腫瘤總發病人數的7.9%)，女性約為22.6萬(占女性惡性腫瘤總發病人數的6.5%)[10-15]。由于我國是慢性乙型肝炎病毒感染人數比例較高，也致使我國肝細胞癌的發病率明顯高于全球平均水平，我國因肝細胞癌死亡的人數占全球肝細胞癌死亡人數的50%以上[10-15]。故探索和發現新的治療肝細胞癌的藥物和方法具有重要的價值和意義。

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)作為左旋精氨酸的衍生物具有多種生物學和藥理學活性[16]。NAC是一種含有巰基(-SH)的化合物，其可以通過裂解粘液性分泌物中粘蛋白的二硫鍵(-S-S)誘導粘蛋白分解，有效降低如痰液等分泌物的粘性，促進分泌物的排除。目前多用于急慢性鼻竇炎和慢性支氣管炎等呼吸系統疾病的治療[16]。進一步的研究還顯示NAC對于過度的氧化應激亦有顯著的抑制作用[16-17]。Xue L等的研究發現NAC對于微囊藻毒素LR (microcystin-LR)誘導的中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster ovary cells,CHO cells)氧化應激反應有顯著的抑制作用[17]。還有研究證實NAC對包括胃腸道腫瘤、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌和口腔鱗狀細胞癌等多種腫瘤細胞的增殖、分化、轉移以及腫瘤血管生長具有顯著的抑制作用[18-19]。如Lee MF等的研究發現NAC可以有效抑制人舌鱗狀細胞癌HSC-3細胞和SCC-4細胞的增殖和分化，同時有效下調腫瘤細胞EGFR/Akt的活化水平[18]。Lee YJ等的研究證實NAC對于前列腺癌PC-3細胞的增殖具有劑量依賴性的抑制作用[19]。本研究中我們發現在低氧環境中肝癌HepG2細胞活性隨時間延長而逐漸下降(P<0.05)；且在對應時間點與低氧組比較，NAC+低氧組細胞活性下降更明顯(P<0.05)。該實驗結果表明在低氧環境下NAC對于肝癌HepG2細胞的增殖有明顯的抑制作用。

缺氧(hypoxia)環境可直接促進腫瘤細胞向高侵襲性和耐藥性等方向演進。進一步的研究表明該過程與缺氧誘導因子-1 (hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)的表達密切相關[8,20]。HIF-1作為一種異二聚體主要受到組織O2的調控，HIF-1由HIF-1α和HIF-1β兩個亞基構成。在非激活狀態下(常氧環境中)細胞內的HIF-1α通過E3泛素蛋白連接酶(E3 ubiquitin-protein ligases)持續的誘導并通過泛素化降解；當在低氧環境中時E3泛素蛋白連接酶的活性被抑制，導致HIF-1α與HIF-1β的結合形成HIF-1α/HIF-1β異二聚體發揮生物學效應[8,20]。研究顯示HIF-1對包括肝細胞癌和非小細胞肺癌在內的多種腫瘤的血管生成、分化、增殖、侵襲和轉移均有重要的調節作用，下調HIF-1的表達和活化對于腫瘤細胞有抑制作用[8,20-21]。如Wei D等的研究發現地高辛可以通過下調HIF-1α的合成有效抑制非小細胞肺癌A549細胞的增殖以及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和N-Myc downregulated gene 1 (NDRG1)的表達[8]。吳曉慧等通過細胞實驗和移植瘤小鼠實驗證實YC-1對于肝細胞癌SMMC-7721細胞有直接的抑制作用并可下調腫瘤細胞VEGF的表達，同時發現該作用機制與抑制HIF-1α的合成密切相關[21]。Hu Y等在對多發性骨髓瘤細胞的研究中證實HIF-1α對于survivin的表達具有關鍵性調控作用，使用siRNA等方法抑制HIF-1α可有效下調骨髓瘤細胞survivin的合成[22]。在本實驗中我們對survivin、VEGF和HIF-1α mRNA和蛋白的表達使用qPCR和western blot進行分析后發現低氧環境可以顯著增加肝癌HepG2細胞survivin、VEGF和HIF-1α mRNA和蛋白的表達水平。同時還發現在干預24h后，NAC+低氧組細胞survivin、VEGF和HIF-1α mRNA和蛋白的表達水平較低氧組細胞顯著下降(P<0.05)。表明NAC對于低氧環境誘導的肝癌HepG2細胞survivin、VEGF和HIF-1α表達有顯著的抑制作用。

4結論

低氧環境中N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)可以通過下調HIF-1α的合成抑制肝癌HepG2細胞survivin和VEGF的表達水平，并可有效抑制腫瘤細胞的增殖。本基礎研究為進一步NAC應用于腫瘤的臨床治療奠定了一定的理論基礎。

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基金項目：重慶市衛生和計生委中醫藥科技項目(ZY201402030)

【中圖分類號】R 735.7

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.07.004

(收稿日期：2015-08-19；編輯：陳舟貴)

N-acetylcysteine inhibits survivin and VEGF expression through down-regulation of HIF-1α in liver cancer HepG2 cells

WANG Tao1,WEN Guihai1,ZHANG Guidong1,et al

(1.Department of The First General Surgery,Handan Central Hospital,Handan 056001,Hebei,China;2.Department of Respiratory Medicine,Traditional Chinese Medical Hospital of Chongqing,Chongqing 400011,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the role of N-acetylcysteine (NAC) on survivin and VEGF expression in liver cancer HepG2 cells in hypoxia,and its underlying mechanism.MethodsLiver cancer HepG2 cells were divided into three group,Normoxia group,NAC+Hypoxia group and Hypoxia group.At different time points (0h,24h and 72h),cell viabilities were measured by MTT assay.After 24 hours interventions,survivin,VEGF and HIF-1α mRNA were evaluated by qPCR.Meanwhile,the protein expression of survivin,VEGF and HIF-1α protein were detected by Western blot.ResultsThe proliferation of liver cancer HepG2 cells under hypoxic conditions was time-dependently reduced by NAC interventions.And we found that hypoxia up-regulated the mRNA and protein expression of survivin,VEGF and HIF-1α in HepG2 cells.Then,our data also figured out that hypoxia-induced up-regulation of survivin,VEGF and HIF-1α was significantly blocked by NAC.ConclusionNAC reduces survivin and VEGF expression probably through the inhibition of HIF-1α in liver cancer HepG2 cells in hypoxia.

【Key words】N-acetylcysteine; Hypoxia-inducible factor-1α; Survivin; Vascular endothelial growth factor; HepG2 cells