問號鉤端螺旋體colA基因產物膠原酶活性及其致病機制研究

趙金方，談潘莉，汪浙炯，胡瑋琳，嚴　杰，Kokouvi Kassegne

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問號鉤端螺旋體colA基因產物膠原酶活性及其致病機制研究

趙金方1，談潘莉1，汪浙炯1，胡瑋琳2，嚴杰2，Kokouvi Kassegne2

1.浙江中醫藥大學附屬第一醫院檢驗科，杭州310006；2.浙江大學醫學院病原生物學系，杭州310058

摘要：目的了解不同問號鉤端螺旋體(簡稱鉤體)血清群colA基因分布和序列保守性、表達產物膠原酶活性以及感染細胞時colA基因表達水平變化和產物分泌情況。方法采用PCR及其產物測序法檢測我國主要流行的7個問號鉤體血清群代表株中colA基因并了解其序列保守性。構建問號鉤體黃疸出血群賴型賴株colA基因原核表達系統，Ni-NTA親和層析法提取表達的目的重組蛋白rColA。采用分光光度法檢測rColA水解I～IV型天然膠原蛋白及Azocoll和Pz-肽合成底物能力并測定其Km和Kcat值。采用實時熒光定量RT-PCR和Western Blot分別檢測問號鉤體賴株感染HUVEC、BEAS-2B、L-02、HEK293細胞時colA-mRNA水平變化及ColA分泌情況。結果不同血清群問號鉤體均能擴增出全長colA基因片段，其核苷酸和氨基酸序列相似性高達99.4%～100%。所構建的colA基因表達系統能有效表達rColA。rColA能不同程度地水解上述6種底物，但水解III型膠原蛋白能力最強(P<0.05)，其Km和Kcat值分別為2.16 mg/mL和35.6 h-1。問號鉤體賴株感染各靶細胞時colA-mRNA水平顯著升高(P<0.01)，問號鉤體-細胞共培養物上清中可檢出ColA。結論問號鉤體colA基因為序列保守、分布廣泛的膠原酶編碼基因，感染細胞時該基因產物表達上調并外分泌，從而在問號鉤體感染宿主過程中發揮實際作用。

關鍵詞：問號鉤端螺旋體；colA基因；膠原酶；表達；分泌

Supported by the grants from the National Natural Science Foundation of China(Nos. 81261160321 and 81171534) and a grant from the Provincial National Natural Science Foundation of Zhejiang Province(No. LQ14H190001)

致病性鉤端螺旋體(簡稱鉤體)感染引起的鉤體病是全球流行的人獸共患傳染病[1]。致病性鉤體有7個基因種(genospecies)，但以問號鉤體(Leptospirainterrogans)流行最廣[1-3]。動物感染問號鉤體后癥狀輕微，但可持續從尿液排出鉤體污染水源和土壤，人接觸疫水或疫土后均發病[3-4]。問號鉤體能迅速穿越人皮膚或黏膜并侵入血流引起鉤體血癥，繼而播散至肺、肝、腎等臟器，部分恢復期病人可有尿液排菌[3-5]。盡管問號鉤體有強大的侵襲力，但其侵襲因子及作用機制了解甚少。

膠原酶是病原菌重要的侵襲性毒力因子，可降解宿主結締組織及胞外基質中的膠原蛋白[6-8]。問號鉤體黃疸出血群賴型賴株基因組中有一個稱為colA的膠原酶基因[9-10]，但其產物功能尚未證實。本研究檢測了我國主要流行的問號鉤體血清群中colA基因分布并進行了序列分析，構建了問號鉤體賴株colA基因原核表達系統并檢測了重組表達產物rColA膠原酶活性及酶動力學特性，以及感染細胞后colA基因表達及其產物外分泌情況，以期為深入研究問號鉤體ColA致病機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1鉤體與細胞株來源及培養問號鉤體黃疸出血群賴型賴株、流感傷寒群流感傷寒型臨6株、秋季群秋季型臨4株、波摩那群波摩那型羅株、七日熱群七日熱型P7株、澳洲群澳洲型65-9株、犬群犬型Lin株由北京中國藥品生物制品研究院提供，人HUVEC臍靜脈內皮細胞、BEAS-2B肺上皮細胞、L-02肝細胞和HEK293腎上皮細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。問號鉤體用EMJH培養液28 ℃培養[11]，細胞株用10%胎牛血清(FCS)dmem或RPMI-1640培養液(GiBco)37 ℃培養。

1.2PCR采用細菌DNA提取試劑盒(Axygen)提取上述問號鉤體基因組DNA，紫外分光光度法測定其濃度[12]。根據GenBank中問號鉤體賴株colA基因序列(accession No.NC_004342)及其限制性核酸內切酶位點分析結果，設計攜帶NdeI和XhoI核酸內切酶位點PCR引物。上游引物：GAG CAT ATG(NdeI) CAA AAT AAT GGC TCT AAA-3′，下游引物：GAG CTC GAG(XhoI) GAA ATT ACA ACT TGA ATT CGC-3′。以100 ng問號鉤體DNA為模板，采用PCR擴增無信號肽序列的colA基因片段(2 589 bp)，反應參數：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 180 s，30個循環；72 ℃ 15 min。擴增產物經溴乙錠預染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢查后，采用T-A克隆試劑盒(TaKaRa)將其克隆入pMD18-T中形成重組質粒pMD18-TcolA，委托上海Invitrogen公司測序。采用BLAST軟件比對不同血清群問號鉤體colA基因的核苷酸和氨基酸序列相似性[13]。

1.3colA基因原核表達系統構建及鑒定問號鉤體賴株pMD18-TcolA與原核表達載體pET42a(Novagen)用NdeI和XhoI(TaKaRa)雙酶切，回收目的條帶后用紫外分光光度法測定其濃度[12]。300～500 ng的colA基因片段與100 ng線性化pET42a混合，在T4 DNA連接酶(TaKaRa)作用下形成重組表達載體pET42acolA。采用CaCl2法將pET42acolA轉化入表達宿主菌E.coliBL21DE3(Novagen)中形成工程菌株E.coliBL21DE3pET42a-colA [12]。該菌株接種于含50 μg/mL卡那霉素(Kan)LB平板(Oxoid)上37 ℃培養18 h，挑取白色菌落在Kan-LB培養液中37 ℃振蕩培養4～6 h增菌，用細菌質粒提取試劑盒(Axygen)提取pET42acolA后再次測序。

1.4rColA表達與提純E.coliBL21DE3pET42a-colA接種于Kan-LB培養液(Oxoid)中，30 ℃振蕩培養2 h，加入0.5 mmol/L IPTG(Sigma)，30 ℃振蕩培養4～6 h，以誘導rColA表達。細菌超聲裂解后12 000 r/min 4 ℃離心30 min，取上清采用Ni-NTA 親和層析柱(BioColor)提取表達的rColA，BCA蛋白定量試劑盒(Beyotime Biotech)和SDS-PAGE分別檢測其濃度和純度[12]。

1.5兔抗rColA血清及其IgG制備1 mg rColA與等體積弗氏完全佐劑混勻，間隔1周背部皮下多點注射免疫家兔4次，末次免疫15 d后采集心血分離血清。采用飽和硫酸銨沉淀及DEAE-52層析柱法分離并獲得兔抗血清中IgG[14]。

1.6rColA膠原酶活性檢測1 mL含100 μg rColA的CBB緩沖液(0.4 mmol/L CaCl2, 50 mmol/L Tris-HCl，pH7.4)中分別加入5 mg的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型天然膠原蛋白底物或Azocoll、Pz-肽化學合成底物(Sigma)，混勻后37 ℃孵育5 h，采用分光光度法分別檢測OD570(Ⅰ～Ⅳ型天然膠原蛋白)、OD520(Azocoll)或OD320(Pz-肽)值，以確定rColA對各型膠原蛋白及Azocoll或Pz-肽的水解活性[15- 16]。

1.7Km值和Kcat值測定膠原酶活性檢測結果顯示，Ⅲ型膠原蛋白為rColA最適底物。1 mL含100 μg rColA的CBB緩沖液中分別加入0.25、0.5、1、2、3、4和5 mg Ⅲ型膠原蛋白，37 ℃孵育5 h后采用上述分光光度法檢測rColA對不同濃度III型膠原蛋白的水解率，獲得的數據用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法計算rColA水解Ⅲ型膠原蛋白的酶動力學參數Km和Kcat值[17]。

1.8感染細胞后問號鉤體總RNA制備問號鉤體賴株培養物12 000 r/min離心15 min(15 ℃)，沉淀的問號鉤體用無抗生素2% FCS dmem培養液重懸，Petroff-Hausser計數板(Fisher Scientific)計數[18]。按問號鉤體：細胞=100∶1的感染指數(MOI)分別感染HUVEC、BEAS-2B、L-02、HEK293細胞1、2、4、8和12 h[19]。0.1%TritonX-100-TBS裂解細胞后，2 000 r/min 4 ℃離心5 min去除沉淀的細胞碎片，取上清12 000 r/min 4 ℃離心15 min沉淀問號鉤體，采用TRIzol試劑(Life Technologies)提取總RNA，分光光度法測定其濃度和純度[12,20]。

1.9實時熒光定量RT-PCR采用Primer Premier 6.0軟件設計問號鉤體賴株colA基因RT-PCR引物，上游引物：5′-CGC TCT TAA ACA GGT AGA ATC TCA AT-3′，下游引物：5′-GAA AAG GAT GAA AAG TTT CGT AAT CC-3′，產物長度134 bp。采用16S rRNA基因為內參照[21]，上游引物：5′-CTT TCG TGC CTC AGC GTC AGT-3′，下游引物：5′-CGC AGC CTG CAC TTG AAA CTA-3′，產物長度145 bp。熒光標記引物由上海Invitrogen公司合成。根據PrimeScript逆轉錄試劑盒(TaKaRa)說明書，將等量各鉤體總RNA樣本逆轉錄為cDNA，超純水稀釋5倍后作為PCR模板。采用SYBR Premix Ex-TaqTM熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa)及LightCycler 480實時熒光定量PCR儀(Roche)進行PCR。反應體系20 μL，內含0.2 μmol/L各引物和2 μL稀釋逆轉錄產物模板。反應參數：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s，40個循環。獲得的colA基因mRNA(colA-mRNA)實時熒光定量PCR數據用ΔΔCt相對定量法進行定量[20]。實驗中用等量EMJH培養液中問號鉤體為對照。

1.10ColA外分泌檢測按上法用問號鉤體賴株分別感染HUVEC、BEAS-2B、L-02、HEK293細胞1、2、4、8和12 h，0.05%NaTDC-PBS裂解細胞后12 000 r/min 4 ℃離心15 min，以去除沉淀的細胞及問號鉤體，取上清用三氯乙酸沉淀法提取總蛋白[14]。以1∶200稀釋兔抗rColA-IgG為一抗、HRP標記羊抗兔IgG(ImmunoResearch)為二抗，采用Western Blot檢測總蛋白樣本中ColA。實驗中以問號鉤體外分泌蛋白Sph2和胞漿蛋白FliY、等量問號鉤體賴株EMJH培養物上清總蛋白為對照[14,22]。

2結果

2.1PCR結果及序列比較不同血清群的7株問號鉤體均能擴增出全長colA基因片段(圖1)，與GenBank中問號鉤體colA基因序列(accession No.NC_004342)比較，所克隆的7個colA基因核苷酸和氨基酸序列相似性高達99.4%～100%。

M: DNA marker. Lane 1: blank control. Lanes 2 to 8: amplicons of colA gene from L. interrogans serovar Lai strain Lai, serovar Grippotyphosa strain Lin-6, serovar Autumnalis strain Lin-4, serovar Pomona strain Luo, serovar Hebdomadis strain P7, serovar Australis strain 65-9 and serovar Canicola strain Lin, respectively.

2.2rColA表達和提取效果在IPTG誘導下，E.coliBL21DE3pET42a-colA能有效表達目的重組蛋白rColA，Ni-NTA親和層析法提取的rColA在分離膠中顯示為單一的蛋白條帶(圖2)。

M: protein marker. 1: blank control(wild-type pET42a). 2 and 3: the expressed and purified rColA protein, respectively.

2.3rColA膠原酶活性問號鉤體賴株rColA能不同程度地水解6種天然膠原蛋白或化學合成底物，但以水解III型膠原蛋白能力最強(P<0.05)(圖3)，rColA水解III型膠原蛋白的Km和Kcat值分別為2.16 mg/mL和35.6 h-1(圖4)。

*: P<0.05 vs the hydrolytic activity of rColA on type-I, type-II or type-IV collagen, and synthetic Azocoll or Pz-peptide substrate.

圖4　rColA水解III型膠原蛋白的Km和Kcat值

2.4感染細胞時colA-mRNA水平顯著上調問號鉤體賴株感染HUVEC、BEAS-2B、L-02、HEK293細胞后，colA-mRNA水平迅速上調，感染4 h時達到峰值，明顯高于EMJH培養基中問號鉤體賴株colA-mRNA水平(P<0.01)(圖5)。

*: P< 0.01 vs the colA-mRNA level in the spirochete incubated in the DMEM medium(0 h)

2.5感染細胞時問號鉤體ColA外分泌問號鉤體賴株EMJH培養物上清中未檢出ColA，感染HUVEC、BEAS-2B、L-02、HEK293細胞后，共培養物上清中可檢出ColA，且ColA水平隨感染時間延長而逐漸升高(圖6)。

圖6　感染細胞時問號鉤體賴株ColA外分泌

3討論

毒力反映了病原微生物的致病能力，主要由侵襲力和毒素兩部分組成。侵襲力是指病原微生物黏附與侵入宿主及細胞、宿主體內或胞內生存與繁殖及擴散的能力，其相關毒力因子主要有黏附素、莢膜和侵襲性酶類，其中膠原酶和透明質酸酶是原核細胞型病原微生物主要的侵襲性酶類[23]。如前所述，問號鉤體能迅速侵入宿主、體內廣泛播散并從感染宿主尿液排出，表明該病原微生物有極為強大的侵襲力[3-5]。因此，若能證明問號鉤體colA基因產物具有膠原酶活性并在感染過程發揮作用，將有助于闡明問號鉤體侵襲力的物質基礎及其作用機制。

不同國家或地區流行的致病性鉤體基因種存在差異，問號鉤體是亞洲、歐洲、北美和南美主要流行的致病性鉤體基因種，迄今從我國鉤體病人分離的致病性鉤體均為問號鉤體[3,24]。盡管有15個問號鉤體血清群及血清型代表株法定用于我國鉤體病血清學診斷，但黃疸出血群賴型、流感傷寒群流感傷寒型、秋季群秋季型、波摩那群波摩那型、七日熱群七日熱型、澳洲群澳洲型、犬群犬型是我國人群感染的主要問號鉤體血清群[25-26]。我們的實驗結果顯示，上述7個問號鉤體血清群及血清型代表株均能擴增出全長colA基因片段，其核苷酸和氨基酸序列相似性高達99.4%以上，提示colA基因序列高度保守且廣泛分布于我國主要問號鉤體血清群中。

迄今我國發現問號鉤體有18個血清群和75個血清型，但我國鉤體病病人中約60%為問號鉤體黃疸出血群感染所致[2,24]。此外，PCR及其產物測序結果已證實我國主要流行的問號鉤體血清群colA基因序列高度保守[27]。因此，本研究中選擇問號鉤體黃疸出血群賴型賴株(國內編號56601)構建colA基因原核表達系統。實驗結果顯示，問號鉤體賴株colA基因原核表達產物rColA能不同程度地水解I～IV型天然膠原蛋白以及化學合成的Azocoll、Pz-肽底物，但以水解III型膠原蛋白能力最強(P<0.05)，其水解III型膠原蛋白的Km和Kcat值分別為2.16 mg/mL和35.6 h-1。I型膠原蛋白主要分布于真皮層細胞胞外基質，II型膠原蛋白僅發現于軟骨和玻璃體，IV型膠原蛋白為血管壁基底膜組分，III型膠原蛋白分布廣泛，可見于真皮、血管壁以及肺、肝、腎、腸組織中[28]。因此，問號鉤體colA基因產物不僅是膠原酶，且其較強的水解III型膠原蛋白能力對于問號鉤體侵入宿主、經血流播散至內臟、尿液中排出等均具有重要意義。

如前所述，問號鉤體感染過程中相繼出現鉤體血癥、內臟播散和尿液排菌，故我們選擇HUVEC臍靜脈內皮細胞、BEAS-2B肺上皮細胞、L-02肝細胞和HEK293腎上皮細胞作為問號鉤體黃疸出血群賴型賴株感染的宿主細胞。我們的實驗結果顯示，EMJH培養基中問號鉤體賴株colA-mRNA水平較低，培養物上清中也未檢出外分泌的ColA，但感染HUVEC、BEAS-2B、L-02、HEK293細胞后，不僅colA-mRNA水平迅速顯著上調(P<0.01)，且問號鉤體與細胞共培養物上清中可檢出外分泌的ColA。與真核細胞不同，原核細胞僅在轉錄水平上調控靶基因表達，即mRNA水平可直接反映靶基因表達水平[12,20-22]。此外，問號鉤體ColA作為侵襲性膠原酶，必須外分泌才能發揮其作用。因此，上述問號鉤體感染細胞時colA基因表達上調并外分泌現象，提示該基因及其產物參與問號鉤體致病過程并發揮實際作用。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.002

通訊作者：Kokouvi Kassegne，Email：med_bp@zju.edu.cn

中圖分類號：R377.5

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)01-0007-06

Corresponding author:Kokouvi KASSEHNE, Email: med_bp@zju.edu.cn

收稿日期：2015-06-03；修回日期:2015-11-02

Collagenase activity and pathogenic mechanism of colA gene product of Leptospira interrogans

ZHAO Jin-fang1,TAN Pan-li1,WANG Zhe-jiong1,HU Wei-lin2, YAN Jie2,Kokouvi KASSEHNE2

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310006,China;2.DepartmentofMedicalMicrobiologyandParasitology,SchoolofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China)

Abstract:To investigate the distribution and sequence conservation of colA gene in different serogroups of L. interrogans, as well as to determine the collagenase activity, expression and secretion of colA gene product of the spirochete during infection of host cells, PCR and its product sequencing were performed in seven L. interrogans serogroups that prevailing in China and the colA gene product of L. interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae serovar Lai strain Lai was expressed by a prokaryotic expression system and extracted by Ni-NTA affinity chromatography. By using spectrophotometry, the ability of the recombinant protein(rColA) to hydrolyze I-IV type natural collagen proteins and two synthetic substrates(Azocoll and Pz-peptide) were determined, and the Km and Kcat values of rColA were also measured. Real-time fluorescent quantitative RT-PCR and Western Blot assay were applied to detect the colA-mRNA level change and ColA secretion of L. interrogans strain Lai during infection of HUVEC, BEAS-2B, L-02 or HEK293 cells. The results showed that the entire colA gene segments were amplified from the different L. interrogans serogroups with high nucleotide and amino acid sequence identities(99.4%-100%). The rColA could hydrolyze the six substrates in varying extents, in which the hydrolytic ability on type-III collagen showed to be the strongest(P<0.05), with 2.16 mg/mL Km and 35.6 h-1Kcat values. The colA-mRNA level of L. interrogans strain Lai was significantly increased(P<0.01) and the secreted ColA could be detectable in the supernatant of L. interrogans-cell co-cultures during infection of different host cells. These results indicated that the colA gene of L. interrogans is a sequence-conserved and extensively distributed collagenase-encoding gene. The up-regulated expression and external secretion of the gene product during infection of host cells imply its practical role in the process of L. interrogans infection.

Keywords:Leptospira interrogans; colA gene; collagenase; expression; secretion

國家自然科學基金(81261160321和81171534)；浙江省自然科學基金(LQ14H190001)